Diversity and complexity of the CD8+T cell responses against a single epitope of adenovirus E1B : the role of antigen dose for shaping the T cell repertoire in vivo and in vitro

Abstract

Adenoviruses have widely been used as a source for gene-transferring vectors, although in vivo application of recombinant adenoviral vectors has some limitations due to destructive host immune responses induced by these viral vectors. On the other hand, it has been revealed that adenoviruses can cause serious diseases in immunocompromised individuals with significant morbidity and mortality, suggesting that the reconstitution of the immunity is critical for the treatment of fatal disease. However, the immune responses to the major epitopes of adenovirus have been characterized poorly. This study describes the characteristics of cellular immune responses against adenovirus in C57BL/6 mice in two aspects. First, a panel of adenovirus-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) clones were established and characterized based on both their fine functional specificity and structural diversity. It was revealed that the clones established in this study seem to be functionally different from the repertoire induced in vivo by virus immunization. In other to address this discrepancy, the role of antigen dose affecting selection of T cell repertoire in vivo as well as in vitro was investigated. In contrast to the previous reports that E1Ap (SGPSNTPPEI) is the only immunodominant epitope in H-2b mice, strong CTL responses could be induced against E1Bp (VNIRNCCYI) of adenovirus type 5 (Ad5), even when whole viruses were used as an immunogen. A panel of E1Bp-specific CTL clones from Ad5-immune mice was established and their peptide specificity was examined. Nine independently induced clones showed a wide range of T cell avidity. The E1Bp wild-type peptide and a panel of peptide variants containing single alanine substitution were used to examine the putative T cell receptor (TCR) contact residues for E1Bp and the antigenic specificity toward polyclonal and monoclonal E1Bp-specific CTLs. E1Bp-specific CTL clones divided into several groups depending on their antigen recognition pattern, suggesting the fine specificity of the CTL response to E1Bp was quite diverse, rather than being limited to a certain clonal preference. Moreover, the peptide variants with a substitution at the major TCR contact residue had an antagonistic property to some of the CTL clones, while it was agonistic to others. This reflected the extensive diversity of the TCR repertoire available for this antigen. Overall peptide recognition patterns of the clones were quite different from those of the ex vivo repertoire, implying in vitro selection of the repertoire. Thus, the relationship between E1Bp-specific T cells expanded in vitro and in vivo with regard to antigen dose was determined, since there are considerable evidences that antigen dose eliciting cytotoxic T lymphocytes in vitro plays an important role in determining quality and quantity of induced CTLs. However, it has not been determined whether the antigen dose also affects T cell repertoire induced in vivo. This study demonstrates that the variation of antigen dose used in vivo as well as in vitro leads to the selection of different T cell repertoire structurally and functionally. CTLs generated in vitro with low antigen dose of 200 pM required only 103-fold less peptide to function similarly with CTLs generated with high antigen dose of 2 mM. These differences in responsiveness were most likely due to the distinctive TCR affinity between high- and low-dose induced CTLs. In addition, it was found that very minor population, which was negligible at the peak of the primary response, became dominant during in vitro culture with high dose antigen, resulting in the remarkable skewing of in vivo repertoire. However, this extreme bias of T cell repertoire by in vitro stimulation was not shown in CTLs elicited with virus challenge of different dose, implying different composition of the repertoire induced in vivo depending on antigen dose. It was supported by the observation that T cell populations derived from high- or low-dose of Ad5 functioned differently on both antigenic specificity and antigen requirement for maximal proliferation in vitro. Furthermore, the predominance of TCR V beta chain in the two T cell repertoires induced with different immune dose was reversed. These results indicate that a given antigen-specific T cell repertoire is composed of individual CTLs requiring a distinct range of antigen dose for activation and expansion in vivo as well as in vitro. It therefore provides a possible explanation for how immune system controls infections with various ranges of antigenic load while avoiding destructive effect on host tissue by inducing the optimal T cells necessary for a distinct antigen dose. Taken together, these results demonstrate that E1Bp-specific T cell repertoire was markedly diverse functionally and structurally. Moreover, the composition of the repertoire could be varied depending on antigen dose used in vivo as well as in vitro. These imply that the functional diversity of the T cells even to a single epitope should be considered in manipulating the immunity to the virus, and in developing adoptive immunotherapy for immunocompromised individuals. ; 아데노바이러스는 생체 내 유전자 전달을 위한 벡터로서 널리 이용되고 있다. 그러나 이들 바이러스 벡터에 의해서 유발되는 숙주의 면역반응으로 인해 재조합아데노바이러스 벡터의 생체 내 응용은 한계가 있다. 한편, 면역약화환자들에게서 아데노바이러스의 감염이 치명적일수 있다는 연구 결과들이 많이 보고되고 있는데, 이들 질환을 치료하기 위해서는 환자의 면역력 회복이 중요하다고 알려져 있다. 그럼에도 불구하고 아데노바이러스의 주요 항원에 대한 면역반응에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 C57BL/6 마우스에서 일어나는 아데노바이러스 특이 세포성 면역반응의 특징에 관하여 다음 두 가지 측면에서 조사하였다. 우선, 아데노바이러스 특이세포독성T세포 클론들을 확립하고, 이들의 기능적 특이성과 구조적 다양성을 조사하였다. 이 과정에서, 본 연구에서 확립한 클론들과 바이러스 면역에 의해 유도된 in vivo repertoire 사이에 기능적인 차이가 있음이 밝혀졌다. 따라서 이러한 차이점을 설명하기 위해 T세포 repertoire의 선택에 영향을 미치는 항원농도의 역할에 대해서 in vivo와 in vitro에서 조사하였다. H-2b 마우스에서E1Ap (SGPSNTPEI) 펩타이드가 유일한 immunodominant epitope으로 작용한다는 이전의 보고내용과 달리, 면역원으로 바이러스를 직접 사용하였을 경우에도 아데노바이러스 타입 5의 E1Bp (VNIRNCCYI) 펩타이드에 대한 면역반응이 잘 유도됨을 확인하였다. Ad5-면역 마우스로부터 E1Bp-특이세포독성T세포 클론들을 확립하고 이들의 펩타이드 특이성을 조사한 결과, 9종의 클론은 다양한 정도의 T 세포 avidity를 보였다. E1Bp 펩타이드와 alanine-치환 변형펩타이드를 이용하여 E1Bp의 예상되는 TCR 접촉 잔기를 조사하고 E1Bp-특이세포독성T세포들의 항원특이성을 분석하였다. E1Bp-특이세포독성T세포 클론들은 항원인식경향에 따라 몇 개의 그룹으로 구분될 수 있었는데, 이는 E1Bp에 대한 세포독성T세포들의 반응성이 일정한 형태로 정해져 있지 않고 다양함을 나타낸다. 또한, 특정 세포독성T세포 클론들에 대해서 antagonist로 작용하는 변형펩타이드가 다른 종류의 세포독성T세포 클론들에서는 agonist로 작용하였다. 이것은 항원 특이 TCR repertoire가 상당히 다양함을 반영한다. 클론들의 전반적인 펩타이드 인식경향은 ex vivo repertoire와는 상당히 다르게 나타났다. 이러한 사실은 in vitro배양 과정에서 repertoire의 변화가 일어났음을 의미한다. 보고에 따르면In vitro에서 T세포를 유도할 때 사용되는 항원의 농도가 유도된 T세포의 수와 반응성에 상당히 중요한 작용을 한다고 알려져 있다. 따라서 in vivo와 in vitro에서 유도된 E1Bp-특이T세포들간의 관계를 항원농도와 관련하여 조사하였다. 본 연구를 통하여 항원특이T세포 repertoire가 in vitro 뿐만 아니라 in vivo에서 적용되는 항원농도에 따라 구조적, 기능적으로 상당히 달라질 수 있음을 알 수 있었다. In vitro에서 200 pM의 펩타이드 농도로 유도된 세포독성T세포들을 2 μM의 높은 항원농도에서 유도된 세포들과 비교했을 때 103배 낮은 펩타이드 농도에서도 동일한 정도의 반응이 유도되었다. 이러한 반응성의 차이는 두 세포독성T세포군의 TCR affinity의 차이에 기인하는 것으로 보인다. 또한 in vitro에서 고농도의 항원펩타이드와 함께 배양할 경우 초기면역반응에서는 확인되지 않는 극소수의 T세포군이 주된 세포군을 이루게 되고, 결과적으로 in vivo에서 유도된 repertoire와는 전혀 다른 repertoire로 변화됨을 확인하였다.그러나 in vitro배양동안 나타나는 이와 같은 현저한 T세포repertoire의 변화는 다른 농도의 바이러스로 면역한 마우스에서는 관찰되지 않았다. 이것은 면역하는 항원의 농도에 따라 유도되는 in vivo repertoire의 T세포 조성이 달라졌음을 시사하는데, 서로 다른 농도의 아데노바이러스를 면역한 마우스로부터 얻은 T세포군들의 항원특이성이 다르게 나타나고 이들이 in vitro 배양에서 필요로 하는 항원펩타이드의 최적농도가 다르다는 결과 또한 이를 뒷받침하고 있다. 뿐만 아니라 다른 농도로 면역한 마우스의 비장에서 얻은 항원특이T세포들의 TCR Vβ usage를 직접 분석한 결과 우세도가 역전되었음을 확인하였다. 이러한 결과들은, 각각의 항원특이T세포들은 활성화되고 증가되기 위해서 서로 다른 농도의 항원을 필요로 하며, 항원특이T세포 repertoire는 이들 T세포들로 구성되어 있음을 제시한다. 따라서 생체는 다양한 농도의 항원에 대해 반응할 수 있는 다양한 종류의 T세포들을 가지는 면역체계를 통해 자기조직의 파괴를 최소화하면서 외부항원을 제어할 수 있으리라고 예상된다. 이상의 결과를 종합해 볼 때, E1Bp-특이T 세포repertoire는 기능적, 구조적으로 상당히 다양하며, in vitro뿐 아니라 in vivo에서 적용되는 항원의 농도에 따라서도 변화되어질 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 연구 결과는 바이러스에 대한 면역조절 또는 면역약화환자를 위한 adoptive immunotherapy의 개발과 이에 관련된 연구를 수행하는데 크게 기여할 것으로 생각된다.