나환자 피부 병변에서 세포사멸과 caspase-1, caspase-3, caspase-8, IFN-gamma 및 iNOS의 발현

Abstract

나병은 Mycobacterium leprae의 감염에 의한 만성질환으로 숙주의 세포면역에 따라 결핵양나에서 나종나까지 다양한 스펙트럼을 갖는다. 병변의 균도말 검사로 2 형으로 분류된 희균나 (paucibacillary leprosy, PB)에는 결핵양나 (TT)와 중간 결핵양나 (BT)가 속하고 다균나 (multibacillary leprosy, MB)에는 나종나 (LL)와 중간 나종나 (BL)가 속한다. LL의 병변은 수많은 대식세포가 나균으로 차있는 것이 특징이다. 세포사멸 (apoptosis)은 정상 또는 비정상 조직의 발달과 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 세포 사망 프로그램이며 세포내 병원균인 미코박테리아의 감염에 있어서 감염이 퍼지는 것을 막아 숙주를 방어하는 역할을 한다. 본 연구는 나균에 대한 세포면역이 높은 PB와 세포면역이 낮은 MB의 파라핀 포매조직을 이용하여 TUNEL방법으로 세포사멸을 관찰하고 CD8, CD68 항체를 이용한 이중 면역 조직 화학 염색으로 세포사멸을 겪는 세포의 종류를 알아보고자 하였다. 그리고, 나환자 피부 병변에서 세포사멸과 관련된 caspase-1, caspase-3, caspase-8, 세포사멸 및 나균 살해에 관여하는 iNOS, iNOS를 유도하며 대식세포 활성화에 주된 역할을 하는 IFN-γ의 발현을 관찰하기 위하여 RT-PCR을 수행하였으며 결과는 다음과 같다. 1. 세포사멸을 보이는 세포의 수는 PB에서 3.5 ± 1.6, MB에서 6.1 ± 3.7로 MB에서 더 많았으나 통계적으로 유의하지는 않았다. 세포사멸을 보이는 세포는 주로 대식세포이며 림프구와 혈관내피세포에서도 세포사멸이 관찰되었다. 2. Caspase-1 mRNA의 발현은 나병 전체에서 1563.9 ± 211.8 INT(intensity)/mm2이었고, LL에서 1587.1 ± 224.8 INT/mm2 , BT에서 1459.5 ± 133.6 INT/mm2, 정상 피부 조직에서 1371.0 ± 235.7 INT/mm2의 순이었다. 각 군 간에 또한 정상 피부 조직과 나병 전체 사이에 유의한 차이가 없었다. 3. Caspase-3 mRNA의 발현은 나병 전체에서 1751.9 ± 168.9 INT/mm2이었고, LL에서 1781.1 ± 143.0 INT/mm2, BT에서 1620.5 ± 282.1 INT/mm2, 정상 피부 조직에서 1161.8 ± 398.7 INT/mm2의 순이었다. Caspase-3 mRNA의 발현은 LL에서 정상 피부 조직보다 (p < 0.05), 또 나병 전체에서 정상 피부 조직보다 (p < 0.05)유의한 정도로 높았다. 그러나 LL과 BT 사이에 유의한 차이는 없었다. 4. Caspase-8 mRNA의 발현은 나병 전체에서 1168.8 ± 247.7 INT/mm2 이었고, LL에서 1261.8 ± 152.0 INT/mm2, 정상 피부 조직에서 788.0 ± 57.9 INT/mm2, BT에서 750.5 ± 29.0 INT/mm2의 순이었다. Caspase-8 mRNA 발현은 LL에서 정상 피부 조직보다 (p <0.05), LL에서 BT보다 (p <0.05), 그리고 나병 전체에서 정상 피부 조직보다 (p <0.01) 유의한 정도로 높았다. 5. IFN-γ mRNA의 발현은 나병 전체에서 1195.4 ± 356.8 INT/mm2 이었고, LL에서 1220.8 ± 393.0 INT/mm2, BT에서 1081.0 ± 72.1 INT/mm2, 정상 피부 조직에서 920.3 ± 36.0 INT/mm2의 순이었다. IFN-γ mRNA 발현은 LL에서 정상 피부 조직보다 (p <0.05), 나병 전체에서 정상 피부 조직보다 (p <0.01) 유의한 정도로 높았다. 6. iNOS mRNA의 발현은 나병 전체에서 1065.4 ± 239.6NT/mm2 이었고, LL에서 1104.8 ± 248.1 INT/mm2, BT에서 888.0 ± 69.3 INT/mm2, 정상 피부 조직에서 839.5 ± 33.8 INT/mm2의 순이었다. iNOS mRNA 발현은 LL에서 정상 피부 조직보다 (p <0.05), 나병 전체에서 정상 피부 조직보다 (p <0.05)유의한 정도로 높았다. 7. 정상 피부 조직, BT, 및 LL 에서 유의한 정상관관계를 보인 것은 caspase-1과 IFN-γ (Spearman 상관계수(γ) = 0.663, p <0.01), caspase-3와 iNOS (γ = 0.617, p <0.05), caspase-8과 iNOS (γ = 0.522, p <0.05) 이었다. BT와 LL 에서는 caspase-1과 IFN-γ간의 정상관관계만 관찰되었고 Spearman 상관계수는 0.651 (p <0.05)이었다. 이상의 결과, 나환자 피부 병변에서 정상에 비하여 세포사멸과 세포사멸 관련인자인 caspase-3, caspase-8, iNOS, 및 IFN-γ mRNA발현이 증가되어 있으며, 이들 중 caspase-8 만이 LL에서 BT보다 높았다. LL에서의 세포사멸 증가에 caspase-8의 역할이 중요하며, 세포사멸 증가에도 불구하고 나균의 수가 감소되지 않는 것을 볼 때 나병에서 대식세포 또는 림프구의 세포사멸이 숙주 방어에 주된 역할을 하지 않고 대식세포 활성화에 따른 이차적인 결과로 생각된다. ; Leprosy is a chronic granulomatous disease caused by Mycobacterium leprae, which is an obligate intracellular pathogen. It presents broad spectrum of clinical manifestations depending on the host s specific cell-mediated immune response to M. leprae. Apoptosis is an unique physiologic process of programmed cell death, playing an important role in the development and homeostasis of both normal and pathologic tissues. In mycobacterial infections, apoptosis of the macrophage is an important defense mechanism, which prevents the spread of the infection. The purpose of this study is to investigate whether apoptosis occurs in leprosy, and whether a positive correlation occurs among caspase-1, 3, 8, IFN-γ, and iNOS among normal tissue, BT, and LL lesions. TUNEL staining and double immunohistochemical staining with anti-CD8, CD68 antibodies were done in paraffin-embedded tissue sections of 10 cases of paucibacillary leprosy and 8 cases of multibacillary leprosy. The mRNA expression of caspase-1, 3, 8, IFN-γ, and iNOS was detected by RT-PCR analysis. The results are summarized as follows: 1. The number of apoptotic cells was 3.5 ± 1.6 in paucibacillary leprosy and 6.1 ± 3.7 in multibacillary leprosy. The difference was statistically insignificant. 2. Caspase-1 was expressed in order of LL, BT, and normal skin, and the differences were statistically insignificant. 3. Caspase-3 was expressed in order of LL, BT, and normal skin. Between LL and normal skin, the difference was statistically significant. 4. Caspase-8 was expressed in order of LL, normal skin, and BT, and differences were statistically significant. Especially, between LL and BT, the difference was statistically significant. 5. IFN-γ was expressed in order of LL, BT, and normal skin. Between LL and normal skin, the difference was statistically significant. 6. iNOS was expressed in order of LL, BT, and normal skin. Between LL and normal skin, the difference was statistically significant. 7. Statistically significant positive correlation between caspase-1 and IFN-γ, caspase-3 and iNOS, and caspase-8 and iNOS was found in normal tissue, BT, and LL. Statistically significant positive correlation between caspase-1 and IFN-γ was shown in BT and LL. In conclusion, apoptosis exists in leprosy lesions and apoptotic cells express CD8 and CD68 positivity. Number of apoptotic cells in multibacillary leprosy lesions was insignificantly more than that of paucibacillary lesions. Agents inducing apoptosis such as caspase-3, caspase-8, IFN-γ, and iNOS significantly increased in leprosy lesions, especially in LL lesions comparing to normal tissues. Apoptosis in the LL lesions might rather be an additive result to macrophage activation than play a defense role. Only the mRNA expression of caspase-8 significantly increased in LL lesions more than in BT lesions. So caspase-8 might be a major player of the apoptotic pathway in LL.