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Effect of ganglioside GM3 on the structure and function of the human erythrocyte glucose transporter (GLUT1)

Title
Effect of ganglioside GM3 on the structure and function of the human erythrocyte glucose transporter (GLUT1)
Authors
윤혜정
Issue Date
1995
Department/Major
대학원 화학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Abstract
Interactions between ganglioside G_M3 and GLUT1 imbedded in the membrane lipid bilayer were studied by post translational modification and fluorescence techniques. G_M3 was incorporated into the outer leaflet of erythrocyte membrane and changed shape of erythrocytes. The size of dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) liposomes was decreased with incorporation of G_M3 due to the larger head group of G_M3. G_M3 increased the methylatability of erythrocyte membrane while ganglioside mixtures, mostly G_M1 and G_D1a did nor alter the methylatability. G_M3 did not alter the methylatability on ghost. Because of resealing process during the preparation, the membrane became more packed and made G_M3 insertion hard. Intrinsic tryptophan residues of GLUT1 were surrounded by a hydrophobic environment as indicated by the emission maximum of 335±3 nm. The fluorescence intensity was increased in the presence of G_M3 by 12 % at 335 nm without shifting the emission maximum. The time-resolved fluorescence decay of intrinsic tryptophan showed a long-lifetime component of 5.0 ns and a short-lifetime component of 1.5 ns, and intrusion of G_M3 into the membrane increased both lifetime components. Recovered lifetime components quenched by acrylamide were greater than that quenched by KI when G_M3 was incorporated into the lipid bilayer. Therefore, the decrease of the solvent accessibility to the intrinsic tryptophan residues upon the incorporation of G_M3 into the membrane suggests that G_M3 may affect the microenvironment of membrane lipids. Furthermore, G_M3 increased the anisotropy of the intrinsic tryptophan of GLUT1 proteoliposomes. The anisotropy of 1, 6 dipheny 1-1, 3, 5-hezatriene (DPH) -probed DMPC model membrane also increased with G_M3 incorporation. The fluorescence intensity was decreased in diabetic ghost and more in the presence of glucose. Diabetic membrane had a larger anisotropy value. This result suggests an increase in the membrane rigidity and subsequent conformational changes of GLUT1. The conformation change of GLUT1 due to G_M3 was further supported by the kinetic analyses. The transport rate of 3-O-methylglucose (3-OMG) increased by 20% with GM2 incorporation on the erythrocytes, while it decreased by 30% with human diabetic erythrocyte. The value of K_M was 0.55 mM for all conditions. Since the quantity of GLUT1 was not altered in the case of diabetes, G_M3 altered the environment of lipid membrane and induced the conformation of GLUT1 directing to inward facing conformation. ; 외부에서 첨가된 강글리오사이드가 적혈구막 포도당이동체의 구조와 기능을 변화시키는 것을 관찰하였다. Protein carboxy1 methyltransferase (E.C.2.1.1.77) 에 의한 포도당 이동체의 메칠화 정도, sepctrofluorometer와 time-correlated single photon counting (TCSPC) 방법을 이용하여 포도당이동체에 내재된 트립토판 형광변화를 측정하여 포도당 이동체의 구조 변화를 조사하였으며 그 기능은 [^3 H]-3-OMG 이동 능력으로 측정하였다. 외부에서 첨가된 G_M3는 적혈구막 이중지질층 중 바깥 층에 들어가서 적혈구의 모양을 변화시켰다. 30μM의 G_M3는 포도당의 이동체의 메칠화를 32% 증가시켰지만, G_M1과 G_D1a를 다량함유하고 있는 소뇌 gamglioside mixture의 경우 140μM 농도에서는 메칠화가 변화되지 않았다. G_M3가 적혈구막의 메칠화를 증가시켰지만 ghost의 메칠화에는 크게 영향을 미치지 못하였다. 이 결과는 ghost의 막 구조가 원상태의 적혈구 막 구조보다 조밀하게 형성되어 G_M3가 삽입되지 못하여 포도당 이동체의 구조가 변화되지 않았음을 설명할 수 있다. 인지질 (DMPC)로 재구성된 인공막은 G_M3가 함께 존재할 때 그 크기가 감소하였으나 비등방성 (Anisotropy)은 증가하였다. 이 결과로부터 G_M3가 단백질이 존재하지 않는 인공막의 질서와 경직상태를 변화시킨 것을 알 수 있었다. 내재된 트립토판 형광세기가 G_M3에 의해 증가되는 현상을 관찰하므로써 인지질로 재구성된 포도당 이동체의 구조변화를 간접적으로 증명하였다. 이 트립토판들은 주위 환경에 따라 두 종류의 소멸시간(lifetime)을 가지며 특히 둘 중 소멸시간이 진 component(5 ns)가 G_M3에 의해 더 영향을 받고 있음이 관찰되었다. 이들 두 종류의 소멸시간은 소광자(quencher)에 의해 모두 감소하였으나 acrylamide의 소광은 G_M3에 의해 회복됨을 보여주었다. 당뇨병 환자의 적혈구 막의 비등방성은 정상인의 경우보다 큰 값이 관찰되었다. 내재된 트립토판의 형광세기는 정상인의 경우보다 당뇨환자의 경우 작게 나타났으며 포도당이 함께 존재하는 포도당이동체의 양은 당뇨병환자의 적혈구막에서도 감소하지 않음이 보고되었으므로 포도당 이동능력의 변화는 포도당이동체의 구조변화에서 유래되었다고 제안할 수 있다. 따라서 외부에서 첨가된 G_M3가 적혈구막에 삽입되어 그 막에 존재하는 포도당이동체의 구조를 변화시키고 포도당을 세포내로 이동시키는 모양을 유지하게 하므로써 포도당 이동체의 기능의 향상되었음을 증명하였다.
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일반대학원 > 화학·나노과학과 > Theses_Ph.D
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