Effect of ganglioside GＭ3 on the structure and function of the human erythrocyte glucose transporter (GLUT1)

Abstract

Interactions between ganglioside G_M3 and GLUT1 imbedded in the membrane lipid bilayer were studied by post translational modification and fluorescence techniques. G_M3 was incorporated into the outer leaflet of erythrocyte membrane and changed shape of erythrocytes. The size of dimyristoylphosphatidylcholine (DMPC) liposomes was decreased with incorporation of G_M3 due to the larger head group of G_M3. G_M3 increased the methylatability of erythrocyte membrane while ganglioside mixtures, mostly G_M1 and G_D1a did nor alter the methylatability. G_M3 did not alter the methylatability on ghost. Because of resealing process during the preparation, the membrane became more packed and made G_M3 insertion hard. Intrinsic tryptophan residues of GLUT1 were surrounded by a hydrophobic environment as indicated by the emission maximum of 335±3 nm. The fluorescence intensity was increased in the presence of G_M3 by 12 % at 335 nm without shifting the emission maximum. The time-resolved fluorescence decay of intrinsic tryptophan showed a long-lifetime component of 5.0 ns and a short-lifetime component of 1.5 ns, and intrusion of G_M3 into the membrane increased both lifetime components. Recovered lifetime components quenched by acrylamide were greater than that quenched by KI when G_M3 was incorporated into the lipid bilayer. Therefore, the decrease of the solvent accessibility to the intrinsic tryptophan residues upon the incorporation of G_M3 into the membrane suggests that G_M3 may affect the microenvironment of membrane lipids. Furthermore, G_M3 increased the anisotropy of the intrinsic tryptophan of GLUT1 proteoliposomes. The anisotropy of 1, 6 dipheny 1-1, 3, 5-hezatriene (DPH) -probed DMPC model membrane also increased with G_M3 incorporation. The fluorescence intensity was decreased in diabetic ghost and more in the presence of glucose. Diabetic membrane had a larger anisotropy value. This result suggests an increase in the membrane rigidity and subsequent conformational changes of GLUT1. The conformation change of GLUT1 due to G_M3 was further supported by the kinetic analyses. The transport rate of 3-O-methylglucose (3-OMG) increased by 20% with GM2 incorporation on the erythrocytes, while it decreased by 30% with human diabetic erythrocyte. The value of K_M was 0.55 mM for all conditions. Since the quantity of GLUT1 was not altered in the case of diabetes, G_M3 altered the environment of lipid membrane and induced the conformation of GLUT1 directing to inward facing conformation. ; 외부에서 첨가된 강글리오사이드가 적혈구막 포도당이동체의 구조와 기능을 변화시키는 것을 관찰하였다. Protein carboxy1 methyltransferase (E.C.2.1.1.77) 에 의한 포도당 이동체의 메칠화 정도, sepctrofluorometer와 time-correlated single photon counting (TCSPC) 방법을 이용하여 포도당이동체에 내재된 트립토판 형광변화를 측정하여 포도당 이동체의 구조 변화를 조사하였으며 그 기능은 [^3 H]-3-OMG 이동 능력으로 측정하였다. 외부에서 첨가된 G_M3는 적혈구막 이중지질층 중 바깥 층에 들어가서 적혈구의 모양을 변화시켰다. 30μM의 G_M3는 포도당의 이동체의 메칠화를 32% 증가시켰지만, G_M1과 G_D1a를 다량함유하고 있는 소뇌 gamglioside mixture의 경우 140μM 농도에서는 메칠화가 변화되지 않았다. G_M3가 적혈구막의 메칠화를 증가시켰지만 ghost의 메칠화에는 크게 영향을 미치지 못하였다. 이 결과는 ghost의 막 구조가 원상태의 적혈구 막 구조보다 조밀하게 형성되어 G_M3가 삽입되지 못하여 포도당 이동체의 구조가 변화되지 않았음을 설명할 수 있다. 인지질 (DMPC)로 재구성된 인공막은 G_M3가 함께 존재할 때 그 크기가 감소하였으나 비등방성 (Anisotropy)은 증가하였다. 이 결과로부터 G_M3가 단백질이 존재하지 않는 인공막의 질서와 경직상태를 변화시킨 것을 알 수 있었다. 내재된 트립토판 형광세기가 G_M3에 의해 증가되는 현상을 관찰하므로써 인지질로 재구성된 포도당 이동체의 구조변화를 간접적으로 증명하였다. 이 트립토판들은 주위 환경에 따라 두 종류의 소멸시간(lifetime)을 가지며 특히 둘 중 소멸시간이 진 component(5 ns)가 G_M3에 의해 더 영향을 받고 있음이 관찰되었다. 이들 두 종류의 소멸시간은 소광자(quencher)에 의해 모두 감소하였으나 acrylamide의 소광은 G_M3에 의해 회복됨을 보여주었다. 당뇨병 환자의 적혈구 막의 비등방성은 정상인의 경우보다 큰 값이 관찰되었다. 내재된 트립토판의 형광세기는 정상인의 경우보다 당뇨환자의 경우 작게 나타났으며 포도당이 함께 존재하는 포도당이동체의 양은 당뇨병환자의 적혈구막에서도 감소하지 않음이 보고되었으므로 포도당 이동능력의 변화는 포도당이동체의 구조변화에서 유래되었다고 제안할 수 있다. 따라서 외부에서 첨가된 G_M3가 적혈구막에 삽입되어 그 막에 존재하는 포도당이동체의 구조를 변화시키고 포도당을 세포내로 이동시키는 모양을 유지하게 하므로써 포도당 이동체의 기능의 향상되었음을 증명하였다.