나병에서의 in situ polymerase chain reaction에 대한 연구

Abstract

PCR(polymerase chain reaction)은 특정부위의 DNA를 증폭하는 기법으로 유전자 검출에 극히 민감하고 비교적 신속한 진단방법이다. PCR을 나병에 적용하여 나균의 수가 적은 조직으로부터 나균을 검출할 수 있으나 이 기법으로는 증폭된 DNA의 조직학적 위치를 알 수 없는 반면 in situ PCR은 세포 내에서 DNA를 증폭시킨 후 이를 in situ hybridization이나 면역조직화학법으로 검출하여 증폭된 DNA의 위치를 확인할 수 있다, 연구대상은 9명의 나환자로 그 중 6명은 근나종 나(borderline lepromatous leprosy, BL), 1명은 나종형 나(lepromatous leprosy, LL)와 2명은 근결핵양 나(borderline tuberculoid leprosy, BT)환자였다. 환자의 생검된 피부조직을 파라핀 포매하여 digoxygenin으로 direct in situ PCR을 시행하기 위하여 HCl과 proteinase K와 같은 조직의 전처리, paraformaldehyde 고정 시기, PCR 횟수 및 PCR 총 반응액의 양 등을 기준으로 최적의 조건을 살펴보고 최적의 조건 하에서 증폭된 DNA를 보인 세포들을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 조직의 전처리 용액을 비교하면 HCl 처리하였을 때 3명의 BL과 1명의 LL에서 증폭된 DNA를 관찰할 수 있었고 proteinase K로 처리하였을 때 조직은 10 g/mL의 농도로 5분간 항온시킨 경우에만 양성 반응이 관찰되었다. 2. Paraformaldehyde의 고정시기는 BL과 LL에서 조직의 전처리 직전과 PCR 직후이었으며 고정시간은 15분이 가장 적절하였다. 3. PCR 총 반응액 양은 40 l에서 조직소실이 가장 적었다. 4. BL 환자조직은 대부분의 슈반세포와 조직구,일부 한선세포에서 강한 양성을 보였다. 몇 개의 혈관내피세포에서 중등도의 양성반응을 보였다. 5. BT 환자조직은 0.2N HCl과 10 g/mL의 proteinase K로 5분간 항온시킬 때 조직소실이 가장 적고 증폭된 DNA도 가장 많이 관찰되었으며, PCR을 25회 시행하였을 때 양성반응을 관찰할 수 없었고 PCR 30회 시행한 경우 양성반응을 관찰할 수 있었다. 6. BT 환자조직은 대부분의 슈반세포, 상피양세포 및 소수의 혈관내피세포에서 강한 양성을 관찰할 수 있었고 모낭세포도 중등도로 염색되었다. 이상의 결과, in situ PCR진단을 위한 최적의 조건은 BL 및 LL 환자 피부조직인 경우 paraformaldehyde로 15분간 고정시킨 후 HCl로 전처리하고 40 l의 반응액으로 PCR을 수행하고 다시 15분간 paraformaldehyde로 고정하는 것이며, BT 환자 피부조직인 경우 paraformaldehyde로 15분간 고정한 후 0.2N HCl과 10 g/mL의 proteinase K로 5분간 항온시킨 후 30회 PCR을 시행하는 것이었다. In situ PCR로 증폭된 DNA를 관찰한 결과 발병기전은 BL과 LL은 혈류를 따라 나균이 신경내 혈관에 도달하여 슈반세포가 감염되며 조직구와 한선세포도 침범 또는 감염되었으며 BT는 나균이 표피, 모낭 또는 표피내 신경을 통해 진피의 슈반세포에 도달하고 표피를 통해 들어온 나균은 혈관내피세포가 표현하는 homing receptor에 의하여 혈관내피세포에 탐식된 것으로 사료된다. ; Polymerase chain reaction from paraffin-embedded tissues has recently been applied for the diagnosis of leprosy. PCR is a highly sensitive technique and the amplified product is detected by gel electrophoresis and Southern blot hybridization. Conventional PCR does not give an information about histopathologic features. On the other hand in situ PCR informs the histopathological location of DNA amplified inside the cells and detected by in situ hybridization or immunohistochemical method. In this study in situ PCR was applied on the paraffin-embedded tissues of borderline leprosy and lepromatous leprosy patients. The optimal condition of in situ PCR in leprosy was searched with the parameters of pretreatment of the tissues such as HCl and proteinase K, fixation time of paraformaldehyde, total volume of PCR and the number of PCR cycles. The paraffin-embedded tissues of one lepromatous leprosy, 6 borderline lepromatous leprosy and 2 borderline tuberculoid leprosy were subjected to in situ PCR. Amplified DNA products on the tissues incorporated by Dig-dUTP were detected by colorimetric method using anti-Dig-alkaline phosphatase conjugate and NBT/BCIP as the substrate. The results were as follows; 1.The amplified DNA was detected using the HCl-pretreated tissues in three of borderline lepromatous leprosy and one lepromatous leprosy. Proteinase K-treated tissues showed positive reaction in only one tissue used in 10 g/mL of proteinase K for 5 minutes in borderline leprosy. 2. The proper time for fixation of paraformaldehyde was before treatment of proteinase K or HCl and after PCR reaction in borderline leprosy . 3. The 40 l of total volume for PCR reaction was enough and minimized the loss of tissues during PCR reaction in the borderline leprosy. 4. The signals were detected in the cytoplasm of most histiocytes and proliferated Schwann cells, some secretory cells of sweat glands and a few endothelial cells in the tissues of the borderline leprosy and the lepromatous leprosy. 5. The best condition of the direct in situ PCR was pretreatment with 0.2N HCl for 40 minutes and then with 10 g/mL of proteinase K at 370C for 5 minutes and 30 cycles of PCR in borderline tuberculoid leprosy. 6. The positive signal was observed within the cytoplasm of the most Schwann cells and epithelioid cells, a few endothelial cells and the epithelial cells of hair follicle in borderline tuberculoid leprosy. As the above results, the best condition of in situ PCR in BL or LL was fixation of 4% paraformaldehyde solution for 15minutes and then pretreatment of 0.2N HCl for 40minutes and PCR with 40 l of total volume and fixation again for 15minutes. The best condition in BT was fixation of 4% paraformaldehyde solution for 15minutes and then pretreatment of 0.2N HCl for 40minutes and 10 g/mL of proteinase K for 5minutes and then 30 cycles of PCR. When the cells with positive signals were compared, the pathogenesis of leprosy is different between BL or LL and BT. It is proposed that the Schwann cells are infected by Mycobacterium leprae reached to the neural vessels through blood stream and eccrine glands are invaded as the pathogenesis of BL or LL. On the other hand, the pathogenesis of BT is proposed in such a way that M. leprae reached to the Schwann cells through the epidermis, hair follicle or intraepidermal nerve and are induced to the endothelial cells by some homing receptors expressed by endothelial cells.