임신말기 C3H쥐에 복강내 lipopolysaccharide 주사 후 태반, 태아와 자궁내막에서의 IL-6, IL-13 및 TIMP-3의 발현에 관한 연구

Abstract

The mechanisms responsible for the onset of labor in women are not completely understood. Growing evidence suggests that bacterial products such as endotoxin could stimulate monocytes or macrophages to produce inflammatory cytokines such as IL-1, TNF, IL-6 and IL-8, which in turn stimulate prostaglandin biosynthesis by amnion, chorion and decidua and result in the onset of labor. Amniotic fluid IL-6 could be a sensitive indicator for prospective diagnosis of acute histologic chorioamnionitis, so amniotic fluid IL-6 is considered as an important cytokine. IL-13 and TIMP-3, recently described, have been known to relate to IL-6. IL-13, a novel T-helper cell lymphokin, has been shown to upregulate IL-6 production in keratinocytes, endothelial cells and mesothelial cells, whereas it downregulates IL-6 production in human monocytes. Tissue inhibitor of metalloproteinase-3(TIMP-3), new type distinct from TIMP-1 and TIMP-2, is known to be stimulated by IL-6. In this study , we examined C3H pregnant mice at 15 days(70% gestation) after treament of lipopolysaccaride(LPS) or phosphate-buffered saline to observe the changes of IL-6 concentration in maternal serum and amniotic fluid and expression of IL-6, IL-13 & TIMP-3 in placenta, chorioamnionic membrane, fetus and endometrium, and to investigate the correlation among IL-6, IL-13 and TIMP-3. The results are as follows : 1. IL-6 in serum and amniotic fluid after treatment of LPS was significantly elevated; peaked at 1, 2, 4, 5 hours and decreased to control level at 8 hours (P<0.05). IL-6 in placenta, chorioamnionic membrane, fetus, decidua and endometrial epithelium was overexpressed significantly at 1, 2, 4 hours after treatment of LPS(P<0.05) which was corresponding to the elevation time of concentration of IL-6 in senum and amniotic fluid. IL-6 overexpression was more strong in fetal tissue such as placenta, chorioamnionic membrane and fetus than maternal tissue such as decidua and endothelial epithelium, but more significantly increased in maternal tissue than fetal tissue after treatment of LPS(P<0.05). Increased concentration of amniotic fluid IL-6 after treament of LPS was equally originated from transplacental crossage of maternal serum IL-6, and direct local production of IL-6 from placenta, chorioamnionic membrane, fetus and decidua(P<0.05). 2 IL-13 in placenta, chorioamnionic membrane, fetus, decidua and endometrial epithelium was overexpressed at 0.5, 1, 2, 4, 5, 8 hours after treament of LPS, but not significant statistically. The overexpression of fetal tissue was more strong than maternal tissue . 3. TIMP-3 was expressed in both of experimental & control groups in placneta, fetus, chorioamnionic membrane and decidua. TIMP-3 was elevated at 0.5 hour, peaked at 2 hours, and decreased at 5 hours after treatment of LPS(P<0.05). TIMP-3 overexpression was more significantly increased in placenta than other tissues (P<0.05). 4. Overexpressions in IL-13 and IL-6 in placenta, chorioamnionic membrane, fetus and decidua and endometrial epithelium revealed direct proportional correlation coefficient(Spearman correlation coefficient, 0.5212 ; P＜0.05). Both of IL-6 and IL-13 were elevated at 1, 2 hours and decreased at 4, 8 hours coincidentally. 5. IL-6 expression was a head of overexpression of TIMP-3 in placenta, fetus, chorioamnionic menbrane and decidua after treatment of LPS. IL-6 elevation preceded TIMP-3 at 0.5, 1 hour ,and IL-6 decrease preceded at 1, 2 hours. In comparision with cotrol group mice, the concentrations of serum and amniotic fluid IL-6 were increased, and IL-6, IL-13 and TIMP-3 in fetal and maternal tissue were overespressed in experimental LPS-treated mice. Overexpression IL-13 and IL-6 revealed direct proportional correlation, and overexpression of IL-6 was ahead of overexpression of TIMP-3 after treatment of LPS. In conclusion, all of IL-6, IL-13 and TIMP-3 may relate with inflammatory response, and changes of IL-13 and TIMP-3 may suggest parallel correlation to the IL-6 in fetal and maternal tissue after treatment of LPS. ; 임신 말기의 자궁 감염시 미생물에서 유리된 물질이 단구세포(monocyte)를 자극하여 cytokines을 분비시키고 이들이 융모막, 양막, 탈락막등에서 prostaglandin 분비를 촉진하므로써 조기분만을 유도 한다고 알려져 있다. 이러한 cytokines 중에는 interleukin-1, interleukin-6(IL-6), interleukin-8, tumor necrosis factor등이 있으나, 이 중 IL-6은 자궁내 염증시 가장 예민한 반응을 나타냄으로 자궁내 감염 진단에 임상적으로 유용하게 사용할 수 있다. 활성화된 T-helper 세포에서 생성되며 염증과 면역 반응의 기능에 관여하는 cytokine인 IL-13과 세포 밖 기질을 분해하는 matrix metalloproteinases의 활성화를 억제하는 tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)의 한 종류인 TIMP-3은 최근 발견된 것으로 IL-6과 IL-13 및 TIMP-3과의 관계는 아직 잘 알려져 있지 않으나, IL-6과 IL-13의 관계를 보면 IL-13이 조혈세포내 단구 세포에서 IL-6의 생성을 억제하나, 각화성 상피세포, 내피세포, 중피세포등 비조혈세포에서는 IL-6의 생성이나 발현을 증가시킨다는 연구 결과가 보고되었다. 또한 TIMP-3은 임신시 자궁 및 태반조직의 증식과 태아 발달에 따라 그 출현 정도가 변화 될 수 있는 물질로 IL-6에 의해 TIMP-3의 생성이 항진된다는 보고가 발표되엇다. 따라서 본 실험은 임신 말기 쥐에 lipopolysaccharide(LPS) 주사 후 양수 및 모체 혈청에서의 IL-6 의 농도 변화와 태반, 태아 및 자궁내막 조직에서의 IL-6, IL-13 및 TIMP-3의 존재 유무 및 생성 변화를 관찰하여 이들의 상호 관계를 연구하고져 하였다. 임신 제15일 된 46마리의 C3H 쥐를 대상으로 하여 이 중 실험군 38마리에는 복강내 LPS를 주사하고 대조군 8마리에는 phosphate buffered saline를 주사하여 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 5시간 및 8시간 후에 모체 혈청 및 양수내 IL-6를 EIA 방법으로 측정하고, 면역조직화학적 방법으로 태반, 태아 및 자궁내막의 IL-6 및 IL-13의 발현 및 PCR을 이용한 조직내 TIMP-3을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. EIA 방법으로 측정시 LPS가 주사된 실험군은 모체 혈청 및 양수 내에서 대조군에 비해 IL-6의 농도가 증가하였고, 이는 LPS 주사 후 1, 2, 4, 5 시간에 증가되었다가 8 시간에는 대조군에 유사하게 감소되는 경향을 보였다. 면역조직화학 염색에서 IL-6은 태반, 태아, 융모양막, 탈락막 및 자궁내막 상피에서 모두 발견되었고, 이는 LPS 주사 후 30분에는 대조군과 유사하였으나, 주사 후 1, 2, 4 시간에는 강한 조직 내 발현을 보여 모체 혈청 및 양수 내 IL-6 농도의 증가 시간과 일치된 소견을 보였다. 대조군 및 실험군의 모든 조직 내의 IL-6 발현은 태아 조직인 태반, 태아 및 융모양막에서 모체 조직인 탈락막 및 자궁내막 상피보다 더 강한 발현을 보였다. 그러나 LPS 주사 후에는 모체 조직에서 태아 조직 보다 더 의의 있게 IL-6 발현이 증가 되었다. LPS 주사 후 증가된 양수내 IL-6 의 농도는 모체 혈청내 IL-6 농도 부분과 태반, 태아, 탈락막 및 자궁내막과 같은 양수 주변 조직내에서의 IL-6 발현 부분이 비슷한 비율로 함께 영향을 미쳤다. 2. IL-13은 면역조직화학 염색에서 대조군 및 실험군의 태반, 태아, 융모양막, 탈락막, 자궁내막 상피세포 모두에서 발현 되었으며, 실험군은 대조군에 비해 모든 시간 대에서 증가된 발현을 보였고, 태아 조직이 모체 조직에서 보다 그 발현 정도가 강한 경향을 나타내었다. 3. TIMP-3을 PCR 방법으로 측정시 대조군과 실험군의 태반, 태아, 융모양막 및 탈락막에서 모두 발현되었고, LPS 주사 후 대조군에 비해 30분에 발현 정도가 증가하기 시작하여 2시간에 최고로 발현되다가 5시간 후에는 발현 증가 추세가 감소되었다. LPS 주사 후 TIMP-3 발현은 태반에서 대조군에 비해 의의있게 증가되었으나, 기타 조직에서는 의의있게 발현이 증가되지는 않았다. 4. IL-6과 IL-13과의 관계를 보면 LPS 주사 후 태반, 태아, 융모양막, 탈락막을 포함한 자궁내막 조직에서 IL-6 및 IL-13의 발현은 대조군에 비해 1시간 후에 증가되고 2시간 후에는 증가 정도가 적어지기 시작하여 4시간 및 8시간 후에는 유사하게 증가된 발현을 보여 서로 비례적 상관 관계를 보였다. 5. IL-6과 TIMP-3과의 관계를 보면 태반, 태아, 융모양막 및 탈락막에서 LPS 주사 후 대조군에 비해 IL-6은 30분및 1시간에 TIMP-3 보다 먼저 증가되었고 1시간 및 2시간에 먼저 증가가 감소되는 양상을 보였다. 이와같은 연구 결과를 종합하여 보면 임신 쥐에서 LPS가 주사된 실험군은 대조군에 비해 양수 및 모체 혈액내 IL-6 증가를 보였고, 자궁내 태아 조직 및 모체 조직의 IL-6, IL-13 및 TIMP-3이 대조군에 비해 그 발현 정도가 증가되었고, IL-6 및 IL-13 발현은 시기적으로 정비례이나, TIMP-3은 그 발현 증가가 IL-6보다 시기적으로 늦게 증가 또는 감소하였다. 따라서 LPS 주사로 인한 임신 말기 쥐의 자궁내 염증 반응 유도시 IL-6, IL-13 및 TIMP-3이 모두 관여되며 IL-6 및 IL-13은 TIMP-3 보다 조기에 작용 할 것이라는 가능성을 제시 할 수 있으나 IL-13 및 TIMP-3은 연구 초기 상태로 이에 관해서는 보다 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.