방사선조사 후 백서소장점모에서 발생하는 신호전달체계에 관한 실험적 연구

Abstract

최근 신호전달체계에 대한 관심의 고조와 함께 신호전달체계에서 중요한 효소로 알려진 phospholipase C(PLC) 동위효소들의 발현이 조직의 종류와 발달과정에 따라 특이한 양상을 보이고 PLC 동위효소 중 PLC-γ1은 세포의 성장, 분화 및 증식에 중추적 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 방사선조사 후 세포내 신호전달에 대한 연구도 최근 활발하여 소장 점막의 재생에 PLC-γ1 및 ras 암유전자단백이 관여하고 조직손상에 protein kinase C(PKC)가 관여하며 그 외에도 타이로신키나제와 nitrogen-activated PKC 등이 방사선조사 후 활성화된다는 연구들이 보고 되었으나 이들의 연구가 단편적이며 아직 확실히 밝혀진 바가 없다. 본 연구는 백서의 소장에 방사선을 조사하여 PLC 동위효소, epidermal growth factor receptor(EGFR), ras 암유전자단백 및 PKC와 같이 신호전달체계에 관여하는 물질들의 발현을 시간적으로 관찰하여 방사선에 의한 소장조직의 손상 및 재생기전을 밝히고자 하였다. 시험동물로는 암수구별없이 생후 4-5개월, 체중 250-300mg의 백서(Sprague-Dawley) 60마리를 대상으로 하였다. 실험군은 전신에 8Gy의 방사선을 조사하고 방사선조사 후 1일, 3일, 5일, 7일, 14일에 각각 10마리씩 희생시켜 소장을 적출하여 사용하였고, 정상대조군은 각 시기별로 2마리씩 사용하였다. 적출된 소장의 반은 즉시 얼려 PLC의 면역블로팅 및 phosphoinositide(PI) 가수분해 활성도 측정에 사용하였고 나머지 반은 포르말린에 고정한 다음 파라핀에 포매하여 조직병리검색과 면역조직화학염색에 사용하였다. EGFR, ras 암유전자단백, PLC, PKC의 발현은 통상적인 면역조직화학염색 즉, 각각의 단클론 항체를 이용하여 modified avidin-biotin complex법으로 관찰하였다. 점막세포의 재생여부는 광학현미경상의 유사분열 수와 proliferating cell nuclear antigen(PCNA) kit을 이용한 증식세포핵 수로 확인하였다. PLC는 PLC-β, -γ,-δ 발현을 모두 검색하였고 각각 면역블로팅과 PI 가수분해 활성도 측정으로 확인하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 첫째, 조직병리학 소견상 방사선 조사에 의한 소장의 조직손상은 1일부터 관찰되어 3일까지 심하였고 재생은 3일과 5일에 현저하였다. 둘째, 면역조직화학염색 결과 PLC-γ1의 발현은 재생을 보이는 3일과 5일에 발현되었으며 5일째의 점막에서 가장 강하게 나타났다. PLC-δ1은 방사선조사 후 손상을 보이는 1일과 3일의 점막에서 강한 발현을 나타내었다. PLC-β1은 모든 실험군에서 발현되지 않았다. 면역블로팅결과도 면역조직화학염색과 일치하는 결과를 보였다. 셋째, PLC-γ1의 활성도를 보기 위한 PI 가수분해 활성도 측정결과는 3일과 5일에 현저히 높은 수치를 보여 방사선조사 후 소장점막의 재생과정의 중요한 신호전달과정이 PLC-γ1이 관여하는 PI 가수분해에 의해 이뤄짐을 알 수 있었다. 넷째, ras 암유전자단백의 발현은 재생이 시작되는 3일부터 나타나 7일까지 지속되었고 EFGR도 재생시기인 3일과 5일에 가장 강하게 나타났고 그 후 점차 감소하는 추세를 보였다. 한편 PKC는 발현이 미약했으나 증식지수가 높은 점막에 3일과 5일에 발현이 관찰되었다. 결론적으로 방사선 조사에 의한 소장점막조직의 손상 및 재생과정의 신호전달기전에 PLC의 신호전달체계에 관여하는 효소가 중요한 역할을 함 특히 PLC-γ1와 ras 암유전자단백, EFGR, PKC는 방사선 조사 후 공장점막세포의 재생시기에 주로 발현되어 재생과정과 관련된 신호전달기전에 관여함을 나타내었다. PLC-δ1은 방사선 조사 후 세포의 손상시기에 강한 발현을 보여 특히 손상과정과 관련된 신호전달기전에 관여함을 추측할 수 있었다. PLC-β1의 발현은 모든 실험군에서 음성인 소견을 보여 방사선조사 후 소장점막의 세포손상 및 재생과정에서 PLC-β1과 관련된 신호전달체계는 관여하지않음을 알 수 있었다. 그러나 이러한 신호전달체계의 기전을 구체적으로 밝히기 위해서는 추후 지속적인 연구가 필요하다고 사료된다. ; Phospholipase C(PLC) isozymes play significant roles in signal transduction mechanism. PLC-γ1 is one of the key regulatory enzymes in signal transduction for cellular proliferation and differentiation. Ras oncoprotein, EGFR and PKC are also known to be involved in cell growth. The exact mechanisms of these signal transduction following irradiations, however, were not clearly documented. Thus, this study was planned to determine the biological significant of PLC, ras oncoprotein, EGFR and PKC in damage and regeneration of rat intestinal mucosa following irradiation. Sprague-Dawley rats were irradiated to entire body by a single dose f 8 Gy. The rats were divided into 5 groups according to the sacrifice days after irradiation. The expression of PLC, ras oncoprotein, EGFR and PKC in each group were examined through the immunoblotting and immunohistochemistry. The histopathologic findings were observed using hematoxylin & eosin stain, and the mitoses for the evidence of regeneration were counted using the light microscopy & PCNA kit. The phosphoinositide(PI) hydrolyzing activity assay was also done for the indirect evaluation of PLC-γ1 activity. In the immunohistochemistry, the expression of PLC-β was negative for all groups. The expression of PLC-γ1 was highest in the group III followed by group II in the proliferative zone of mucosa. And the expression of PLC-δ1 was storongly positive in group I followed by group II in the damaged surface epithelium. The above findings were also confirmed in the immuniblotting study the expression of PLC-β ,PLC-γ1 and PLC-δ1 were the same as the results of immunohistochemistry. The expression of ras oncoprotein was weekly positive in group II, III, and IV. The expression of EGFR was the highest in te group II, III, followed by group IV and the expression of PKC was weekly positive in the group II and III. These studies suggest that PLC-γ1 mediated signal transduction including ras oncoprotein, EGFR, and PKC plays a significant role in mucosal regeneration after irradiation, PLC-δ1 mediated signal transduction might have an important role in mucosal damage after irradiation. Further studies will be necessary to confirm the signal transductionmediating the PLC-δ1.