Controlled drug release from biodegradable polymeric systems for tissue regeneration

Abstract

치주조직 재생치료에 있어서 최적의 효과를 제공하기 위해 유도조직재생막과 골결손부 대체 및 골세포 이식용 충전물질을 병용하여 적용하는 것에 관한 연구를 수행하였다. 각기의 방법은 그 자체로도 특유의 골재생력을 발휘하며 이들을 병용하여 적용할 경우 상승효과에 의해 조직재생력이 현저할 것으로 예측되었다. 본 연구에서는 병용적용에 관한 두가지의 접근방법을 연구하였다. 하나는 유도조직재생술에 이용되는 다공성 약물함유 폴리락트산의 차폐막이고 다른 하나는 스폰지 형태의 골세포 이식용 지지체이다. 치주조직 유도재생에 적합한 생체 적합성이며 생분해성인 약물 함유 다공성 폴리락트산의 차폐막을 염화메틸렌과 에틸아세테이트의 혼합용매를 이용하여 용해시킨 폴리락트산 용액을 폴리글리콜산의 직조물에 피복시키고 건조하면서 일어나는 상분리법에 의해 제조하였다. 제조된 차폐막은 체내에서 저분자량의 영양원은 통과하면서 상피하방의 침식은 충분히 저지할 수 있는 다공성 구조를 보였다. 제조된 테트라사이클린, 플루르비프로펜 및혈소판유래 성장인자 함유 차폐막으로부터의 약물용출실험결과 약물은 다공성 차폐막의 내부로부터 확산 및 용해의 제어로 용출이 조절되었으며 더 나아가 혼합용매의 비율, 약물함량 및 성장인자의 경우 첨가된 알부민의 양에의해 방출이 조절될 수 있음을 알 수 있었다. 생체내에서의 약물방출 실험결과 조직내에서 4주간 유효한 농도를 지속적으로 방출하고 있음을 관찰하였다. 성장인자는 차폐막 내에서 그 생리활성이 유지되었으며 이는 화학 주성실험을 통해 확인하였다. 다공성 차폐막은 4주간의 생분해실험으로 60%이상의 중량을 유지함으로써 치주조직의 재생을 유도할 수 있는 차폐막으로서의 기능을 발휘할 수 있음을 알 수 있었다. 약물함유 차폐막에 대해 골아세포를 대상으로 세포접착실험을 실시한 결과 세포에 친화성을 지님을 알 수 있었다. 또한 약물함유 차폐막을 백서의 골결손부에 이식하여 골재생력을 관찰한 결과 대조군에 비해 약물함유 차폐막에 의한 골신생이 증가하였는데 이러한 경향은 성장인자를 함유한 차폐막에서 더욱 현저하였다. 이러한 실험결과로서 약물함유 폴리락트산의 치주조직 유도재생에서 유용한 제제로서의 활용성이 기대되었다. 차폐막과 함께 병용되어질 골세포이식용 지지체로서의 스폰지를 개발하기 위해서는 키토산으로 이루어진 스폰지가 제작되었다. 키토산은 자체가 골치유를 증진시키고, 골세포의 석회화를 촉진하는 것으로 알려져 있다. 키토산과 트리칼슘인산, 황산콘드로이틴 및 혈소판유래 성장인자를 첨가하여 조직공학적인 골형성을 위한 3차원적 세포배양 지지체로서의 유용성 및 나아가 골결손부에서의 적용성을 고찰하고자 하였다. 키토산 용액 및 트리칼슘인산, 황산콘드로이틴이 첨가된 키토산의 용액으로 동결건조법에 의하여 100-200㎛직경의 다공성 구조를 지니는 스폰지를 제작하였다. 골형성력을 증가시킬 목적으로 혈소판유래 성장인자를 스폰지에 함유하도록 하였다. 성장인자는 100, 200, 400ng이 각 스폰지에 함유되도록 하였고 이들의 방출실험 결과 함유량에 따라 방출이 조절될 수 있음을 알 수 있었으며 더욱이 첨가된 트리칼슘인산 및 황산콘드로이틴에 의해서도 방출이 조절됨을 확인하였다. 스폰지로부터 성장인자는 세포의 증식을 증진시킬 수 있는 유효한 농도로 방출되었고 또한 그 생리활성이 유지되고 있음을 화학주성실험 및 세포접착력 실험을 통해서 확인하였다. 골아세포를 스폰지에 접종하여 배양한 결과 접종후 배양 21일까지 골아세포의 수는 지속적으로 증가하다가 이후에는 56일까지 성장속도가 둔화되었다. 염기성인산효소의 활성 및 칼슘의 축적량은 접종후 배양시간결과에 따라 56일까지 지속적으로 증가하였다. 이러한 양상은 트리칼슘인산 및 황산콘드로이틴을 함유한 키토산 스폰지가 함유하지 않은 스폰지에 비해 크게 나타났으며 첨가된 성장인자에 의해서도 증가됨을 알 수 있었다. 배양된 골세포가 접종된 키토산 스폰지의 조직학적 관찰결과 골아세포는 스폰지에 잘 부착하여 중층의 형태로 성장하면서 광화된 골기질을 형성함이 관찰되었다. 배양 14일째부터 작은 골편형태의 골형성이 스폰지 기질표면에 부착되어 관찰되었고 배양기간이 길어짐에 따라 성장하여 배양 56익째에는 상당한 양의 골질이 형성됨을 관찰하였다. 이러한 현상은 트리칼슘인산, 황산콘드로이틴 및 성장인자를 함유한 경우 현저함을 알 수 있었으며 특히 배양 56일 동안의 광화된 골질 및 칼슘축적량은 트리칼슘인산을 함유한 키토산 스폰지에서 더 증가하였다. 이러한 결과로서 키토산 및 각 첨가물을 함유한 키토산 스폰지가 조직공학적 골형성에 있어서 약물을 조절방출시킬 수 있으며 아울러 골아세포의 배양을 위한 3차원적 구조의 지지체로 이용될 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 2가지 시도, 즉 차폐막과 스폰지의 연구결과 각 제제는 각각이 약물조절 방출능을 가지고 있으며 골형성력을 보유하고 있음을 알 수 있었으며 이들이 혼합되어 병용적용시 골결손부에서 현저한 골신생을 유도할 수 있음이 제시되었다. ; With an aim of providing effective periodontal therapeutic modality, combinative method that composed of guided tissue regenerating membrane and bone substituting bone cell transplanting scaffolds were developed. Each method have its typical bone regenerating potential, therefore, combination of these two method might be beneficial in improving periodontal bone regenerating capacity by synergic effect. In this study, two approaches were developed for combining their efficacy. The one approach was guided tissue regeneration(GTR) by using drug loaded porous PLLA membrane and the other was bone cell transplanting spongeous scaffold. As GTR membrane, biodegradable barrier membranes composed of porous poly(L-lactide)(PLLA) films cast on poly(glycolide)(PGA) meshes were fabricated using an in-air drying phase inversion technique. PLLA was dissolved in methylene chloride-ethylacetate mixtures and cast on the knitted PGA mesh, followed by air-drying process. The use of three component polymer solution(PLLA-methylene chloride- ethylacetate) was to generate porous substructures in the PLLA membranes during the solvent evaporation. The PGA meshes mechanically holding the PLLA membranes played an important role in forming surface pores. Size and morphology of the pores were affected by the solvent composition of methylene chloride and ethylacetate. Homogeneous pores were generated both at the surface and sublayer of the membranes. Flurbiprofen, tetracycline, and platelet-derived growth factor(PDGF-BB) that are used in periodontal therapy due to their tissue regenerating effects, were incorporated in the membranes by adding the drugs in the PLLA solutions. The drug release kinetics mainly depended upon hydrophobic-hydrophilic properties of the drugs and porosity of the membranes regulated by solvent composition of the PLLA solution. The release rate could be further controlled by loaded drug contents. Release kinetics of PDGF-BB, biologic activity, degradability and guided tissue regenerative potentials of the membranes were investigated. Release of PDGF-BB could be controlled by adding bovine serum albumin that may provide porous diffusion channels for PDGF-BB release and by varying initial loading content of PDGF-BB. Biologic activity of PDGF-BB in the membranes was ascertained by fibroblast chemotaxis. The membranes maintained proper degradation property ,that is, sustained degradation with retaining their morphology, which is good for periodontal application. Drug and PDGF-BB loaded membrane markedly increased new bone formation in rat calvarial defects, and completed bony reunion after 2 weeks of implantation period. These results suggested that drug or PDGF-BB loaded PLLA membrane might potentially enhance guided tissue regenerative efficacy. As the second approach, chitosan sponges that have release controlling capacity of growth factor and serve as a tissue transplanting scaffolds, were developed for bone regeneration. Additives such as tricalcium phosphate, chondroitin sulfates were added into ths sponges to enhance bone forming capacity. Chitosan solution or mixture of chitosan and TCP or chitosan and chondroitin sulfate was freeze dried and crosslinked. 100, 200, 400 ng of platelet-derived growth factor (PDGF-BB) was loaded into these chitosan sponges. PDGF-BB release experiment was performed for 4 weeks. Bone formation was investigated in in vitro by culturing fetal calvarial osteoblast in chitosan sponges. Osteoblasts were seeded within chitosan sponge with the density of 1 x 10^5 cells/㎠ and were examined for cell proliferation, alkaline phosphatase activity, calcium content, mineralizing matrix formation over 8-week culture period. Porous spongeous matrix with average diameter of 100-200㎛ was obtained. Consistent release of PDGF-BB was observed after initial burst effect. TCP could increase bone cell adaptation in chitosan sponge, furthermore, release rate was increased by adding TCP into chitosan sponges. Rapid release at the initial step might be advantageous for bone cell induction and migration at wound site. Chondroitin sulfate loaded within chitosan sponge could improve osteoblast differentiation, moreover, PDGF-BB release could be regulated by using chondroitin sulfate. Initial burst release was reduced and maintenance level was increased for 4 week period probably due to ionic interaction. Chitosan sponges supported the proliferation of seeded osteoblasts as well as their differentiation function, as demonstrated by increased alkaline phosphatase activity, increased calcium content, mineralized matrix formatin by the cells over time. Higher mineral deposition was observed in TCP or chondroitin sulfate loaded chitosan sponge demonstrating that these material enhanced osteoblast differentiation. Furthermore, PDGF-BB loaded sponge showed significant osteoblast proliferation, mineralizing matrix formation. These results provided the practicability of using chitosan sponges containing bioactive materials such as ceramic, chondroitin sulfate, growth factor as as scaffolding devices for the transplantation of autogenous osteoblasts to reconstruct bone tissue. Therefore, these studies suggested the feasibility of using combination of both drug loaded GTR membrane and tissue engineered bone substituting chitosan scaffold in enhancing bone regeneartion efficacy for periodontal therapy.