일차 배양된 흰쥐 간세포에서 glycochenodeoxycholic acid의 세포손상기전

Abstract

간세포내 담즙 축적에 의한 담즙 정체는 간세포 손상을 일으키는데 이는 소수성의 담즙산이 과다하게 축적되어 나타난다. 일반적으로 세포손상은 세포괴사(necrosis)와 세포고사(apoptosis)에 의하므로 담즙산에 의한 간세포 손상도 세포괴사 또는 세포고사의 양상을 보일 것으로 생각되나 이에 대한 상반된 연구 결과가 보고되고 있다. 또한 여러 세포의 세부적 손상기전의 하나로 산화 손상이 거론되는데 소수성 담즙산에 의한 간세포 손상의 정확한 기전은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 collagenase 관류법에 의하여 일차 배양된 간세포를 이용하여 소수성 담즙산 중 담즙 정체시 가장 많은 증가를 일으키며 가장 독성이 강하다고 알려진 glycochenodeoxycholic acid(GCDC)를 다양한 농도로(50-400μM) 투여한 후 시간(1시간-5시간)에 따른 변화를 관찰하여 세포 손상의 형태학적, 생화학적 변화 및 손상기전을 알아보고자 실험을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. Propidium iodide와 fluorescein diacetate로 이중 염색한 후 현미경으로 관찰하였을 때 GCDC 투여는 농도 및 시간 의존적으로 생존 세포수를 감소시켰다. 2. GCDC 투여 후 세포외액으로의 LDH 유리는 GCDC 농도 증가에 따라 의의있게 증가되었고 이러한 변화는 시간 경과에 따라 현저하였다. 3. 1.5% Agarose gel 전기영동실험에서 3시간군에서 200μM GCDC 투여시 가장 현저한 분절 현상을 나타내었다. 4. 7-Amino Actinomycin D 염색 후 flow cytometry로 분석하였을 때 1시간째에는 주로 200μM GCDC 투여군에서 세포고사군의 분획이 증가되었으며, 3시간째에는 200μM 및 100μM GCDC 투여군에서 가장 현저한 세포고사군의 분획 증가를 나타내었다. 5. GCDC 투여 후 지질 과산화는 GCDC 농도 및 시간 경과에 따라 현저히 증가되었다 6. GCDC 투여 후 간세포내 glutathione 농도는 GCDC 농도 증가에 따라 의의있게 감소되었고 이러한 변화는 시간 경과에 따라 현저하였다. 이상의 성적으로 보아 소수성 담즙산인 glycochenodeoxycholic acid는 세포괴사 및 세포고사에 의한 간세포 손상을 모두 야기하며 특히 저농도에서 세포고사를, 고농도에서는 주로 세포괴사를 나타내며 이러한 손상기전에는 지질과산화가 일부 관여될 것으로 생각된다. ; In cholestasis, intracellular accumulation of hydrophobic bile acids has been shown to be cytotoxic for hepatocytes. Accumulation of bile salts may be associated with lysis of the plasma membrane and cell necrosis. Recently, however, morphologic feature of apoptosis has been frequently identified in human cholestatic liver disease. The precise cellular mechanisms by which bile acids produce liver injury are unclear. This study was, therefore, aimed to determine the mechanism of hydrophobic bile acid, glycochenodeoxycholic acid(GCDC)-induced hepatotoxicity in primary cultured rat hepatocytes. The results obtained are as follows; 1. GCDC administration decreased cell viability in cultured hepatocytes in dose and time-dependent manner. 2. GCDC administration increased extracellular LDH releases from cultured hepatocytes in dose and time-dependent manner. 3. DNA fragments was observed on 1.5% agarose gel electrophoresis after 3 hour of incubation with 200μM concentration of GCDC. 4. In flow cytometric analysis, apoptotic death was observed after 1 hour of incubation with 200μM concentration of GCDC, 3 hour with 100 and 200μM concentration of GCDC. 5. GCDC administration increased lipid peroxidation in cultured hepatocytes in dose and time-dependent manner. 6. GCDC administration decreased intracellular glutathione concentration in cultured hepatocytes in dose and time-dependent manner. This study suggest that both necrosis and apoptosis are linked to GCDC-induced hepatocellular injury. At low concentration, GCDC caused cell necrosis, whereas high concentration of GCDC resulted in apoptosis. And lipid peroxidation may play role in mechanism of GCDC-induced hepatocellular injury.