Identification of interacting partners for CCR5 and Rnd1 and development of chemokine reporter gene assay

Abstract

Chapter Ⅱ : CC Chemokine Receptor 5, CCR5, Interacts with Lymphocyte Specific Kinase, Lck Chemokines are small pro-inflammatory cytokines associated with leukocyte chemoattraction. Chemokines are divided into 4 subfamilies; CXC, CC, CX_3 C, and C, and they differ functionally. Interestingly, some chemokine receptors act as co-receptors for HIV-1 together with CD4. Chemokine receptors are G-protein coupled seven transmembrane proteins and their cellular signal pathways are known to be transduced by G protein or protein kinase such as Jak/STAT. But the cellular signal pathways of human chemokine receptors are not well defined. To elucidate the cytoplasmic signal pathways of human CC chemokine receptor 5 (CCR5), yeast two-hybrid screening was performed with carboxyl terminal part of CCR5 (55 amino acids) known as the co-receptor for M-tropic HIV in the human T cell library. I have isolated several clones, encoding proteins that interact with carboxyl terminus of CCR5: these were farnesyl pyrophosphate synthetase, glycosylation inhibiting factor, and lymphocyte specific tyrosine kinase (Lck). For further analysis, I have focused on Lck, which is known as an intracellular signal transducer of CD4, the receptor for HIV entry. The binding domain within Lck was mapped in yeast. The interaction between CD4/CD8 binding domain of Lck and carboxyl terminus of CCR5 turned out to be the strongest, producing about 64-fold greater than that of the background as measured in an ONPG assay, whereas SH3-, SH2-, CD4/CD8 binding domain deleted Lck (△CD4/CD8 Lck) resulted in a loss of the capability of interaction. A direct interaction of Lck and the carboxyl terminus, or intact CCR5 could be demonstrated through in vitro experiments. I was also able to observe an in vivo interaction of both proteins by co-immunoprecipitation analysis. Co-receptor for T-tropic HIV-1, CXCR4 carboxyl terminal part (47 amino acids) did not bind to Lck implying that interaction between CCR5 and Lck is a specific one. In summary, the carboxyl terminus of CCR5 interacts with CD4/CD8 binding domain of Lck and transduces its signal in vivo and in vitro while CXCR4 does not.

Chapter Ⅲ. : Small GTP-binding protein Rnd1 Interacts with Prenylcysteine Carboxylmethyl Transferase in yeast two hyrid system Rnd proteins, Rnd1, Rnd2, and Rnd3, were isolated as new members of Rho family, and they form a distinct branch of it. Rnd proteins spontaneously bind GTP, with no need for an exchange factor. Furthermore, Rnd proteins have no detectable GTPase activity and these proteins are the first example of a small GTP-binding protein that does not switch between GDP- and GTP-bound forms. Almost no effector and/or potential target have been characterized and signal transduction or the physiological roles of Rnd proteins human T cell has not been established. As a result, I looked for cellular factors interacting with Rnd1 in a yeast two-hybrid screen. Using a human T cell library fused to the GAL4 activation domain, I was able to identify 9 positive clones: 3 of which were of phosphodiesterase delta subunit (PDEδ), 1 of which was of heat shock protein 90 (HSP90), and 5 of which comprised of prenylcycteine carboxyl methyltransferase (pcCMT), the most abundant one. The last one was identified from a mammalian system very recently as a post-translational modifier of the carboxyl terminal CAAX motif. Interaction between Rnd1 and pcCMT turned out to be very strong, producing b-galactosidase levels which is 567-fold greater than that of the background, as measured in an ONPG assay, whereas the β-galactosidase levels between CAAX motif deleted Rnd1and pcCMT decreased about 58%, indicating that C residue in Rnd1 is not the whole interacting site for pcCMT because they interact each other after C residue was deleted. From this study, I suppose that pcCMT is a strong interaction partner for Rnd1 for its post-translational modification and their interaction is partially mediated by the CAAX motif of Rnd1 protein.

Chapter Ⅳ: Development of Chemokine Assay Using PKC-responsive Reporter Gene construct Chemokines mediate the migration and activation of leukocytes at sites of inflammation and these properties have been exploited to assay the chemokines. Chemokine receptor, which is a G-protein coupled receptor that transduces its signal via IP_3/DAG pathway, mostly activates protein kinase C (PKC). In this study, I intended to measure signaling activity of chemokine receptor, CCR5 using a protein kinase C-responsive reporter gene instead of measuring the formation IP_3 or mobilization of Ca^2+. Human embryonic kidney cells which are stably expressing chemokine receptor CCR5 (HEK-CCR5, 3*10^5 cells) were transiently transfected with 5 ㎍ of PKC-responsive reporter gene construct fused with luciferase, pAP1-fos-Luc. Addition of MIP-1b (31.5 ~ 250ng/ml), one of the ligands of CCR5, to the transfectants for 12 hours at 37℃ resulted in a dose-dependent increase in luciferase activity in the cell lysates. Other ligands of CCR5, RANTES and MIP-1α also showed dose-response patterns. Furthermore, the induction of luciferase activity by RANTES, MIP-α, and MIP-1β was inhibited to background level by addition of anti-CCR5 antibody. These studies imply that the reporter assay using PKC-responsive reporter gene can be used as an in vitro bioassay of chemokines. ; 제1장 : 케모카인 수용체 CCR5와 림프구 특이성 타이로신 카이네이즈 Lck의 상호결합에 관한 연구 케모카인은 백혈구들의 화학주성에 관련된 분자량 10kDa정도의 Pro-inflammatory cytokine의 일종이며 시스테인을 가지는 구조적 특징에 따라 CXC, CC, CX_3 C, and C의 4그룹으로 나뉘고 이들은 각각 서로 다르게 기능을 한다. 어떤 케모카인의 수용체는 CD4와 함께 HIV-1의 공동 수용체로 사용되는 특징이 있다. 케모카인 수용체는 G-protein coupled seven transmembrane proteins으로서 세포내 신호전달은 한정적으로 G protein 이나 Jak/STAT 같은 카이네이즈를 통하여 이루어 진다고 알려져 있다. 이에 본 연구자들은 케모카인 수용체 CCR5의 세포내 신호전달 체계를 알아보기 위하여 M-tropic HIV의 공동 수용체로 사용되는 CCR5의 카르복실 말단부분 (55 아미노산)과 상호작용하는 단백질을 yeast two-hybrid 기법을 사용하여 인간 T세포 cDNA library에서 탐색하였다. 본 연구자들은 CCR5 카르복실 말단과 yeast상에서 결합하는 3가지의 클론을 고를 수 있었는데 이들은 farnesyl pyrophosphate synthetase, Glycosylation inhibiting factor, and lymphocyte specific tyrosine kinase (Lck). Lck는 HIV의 세포 수용체인 CD4의 신호전달을 담당하는 단백질로서 본 연구는 Lck와 CCR5의 결합에 중점을 두고 있다. CCR5 카르복실 말단과 결합하는 Lck상의 결합부위를 알아보기 위하여 여러종류의 Lck 변이체를 제조하여 two hyrid를 실시한 결과 CD4/CD8 binding domain을 통하여 결합함을 알 수 있었다. 또한 T-tropic HIV의 공동 수용체로 사용되는 케모카인 수용체 CXCR4와 Lck는 결합하지 않는 결과를 보여 이 CCR5와 Lck의 상호작용은 특이적인 것으로 나타났다. 여러 종류의 in vitro 실험을 통하여 확인한 결과, 두 단백질의 직접적인 결합을 알 수 있었고 co-immunoprecipitation 분석을 통하여 알아본 결과 in vivo상에서도 결합을 확인할 수 있었다. 이 연구를 통하여 케모카인 수용체 CCR5가 Lck의 CD4/CD8 binding domain과의 결합을 통하여 신호를 전달함을 확인 할 수 있었고 앞으로 두 단백질간의 상호결합이 세포 내에 어떠한 기능을 수행하는 가에 대한 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 사료된다.

제2장 : Yeast two-hybrid system을 이용한 GTP 결합단백질 Rnd1과 Prenylcysteine Carboxylmethyl Transferase 의 상호작용 연구 Rnd 단백질은 Rnd1, Rnd2, and Rnd3로 되어 있고 최근 GTP 결합 단백질인 Rho family의 한 구성원으로 발견되어 독특한 한 가지를 이루고 있다. Rnd는 자생적으로 GTP와 결합되어 있는 상태를 유지하며 GTP 교환인자를 필요로 하지 않는다. 더욱이 Rnd 단백질에는 GTPase 활성이 발견되지 않는데 이는 GTP 결합 단백질중 유일하게 GTP-, GDP- 교환을 하지 않는다. 최근에 발견되었기 때문에 지금까지 세포 내에서 Rnd에 대한 effector나 잠재적인 표적 단백질에 대한 연구는 거의 이루어 지지 않고 있다. 이에 본 연구자들은 yeast two-hybrid 기법을 사용하여 Rnd1과 상호 작용하는 단백질들을 인간 T세포 library에서 탐색하였다. 그 결과 9개의 클론을 찾았고 그 중 3개는 phosphodiesterase delta subunit (PDEδ), 1개는 heat shock protein 90 (HSP90), 그리고 5개는 prenylcycteine carboxylmethyltransferase (pcCMT)이었다. 가장 많은 클론이 나온 pcCMT와 Rnd1간의 상호작용에 대해 더 알아 보았다. PcCMT 또한 최근에 발견되었는데 CAAX motif의 단백질번역후 변형을 담당하고 있는 단백질이다. Rnd1과 pcCMT간의 상호작용은 매우 강력한 것으로 나타났는데 ONPG assay로 b-galactosidase levels을 측정해 본 결과 기저 수준에 비해 567배나 증가하였다. 또한 결합부위를 탐색을 위해 Rnd1의 CAAX motif를 제거한 변이체를 만들어 pcCMT와 yeast two-hybrid를 실시한 결과 Rnd1과 pcCMT의 상호결합의 강도가 58% 이하로 떨어지긴 하였으나 기저 수준에 비해서는 높은 것으로 나타나 Rnd1과 pcCMT의 결합에는 CAAX motif 이외에 다른 부위가 관여함을 시사하였다.

제3장 : PKC에 의해 반응하는 보고유전자를 이용한 케모카인의 시험법 연구 케모카인은 백혈구를 활성화시켜 염증부위로 이동시키는 과정을 조절하는데 이러한 성질은 케모카인의 생물활성 측정에 이용되어 왔다. 케모카인 수용체는 G-protein과 결합되어 있으며 IP_3/DAG 경로를 통하여 신호를 전달하는데 이 과정중 protein kinase C(PKC)를 대부분 활성화시키게 한다. 본 연구자들은 케모카인의 전통적인 활성측정법인 IP_3의 생성이나 세포 내 Ca^2+을 측정하는 방법 이외에 PKC에 반응하는 보고 유전자를 사용하여 케모카인 수용체 CCR5의 신호전달 능력을 케모카인의 활성과 연계하여 측정하는 방법을 확립하고자 하였다. 케모카인 수용체 CCR5를 안정적으로 발현하는 human embryonic kidney cell(HEK-CCR5)에 PKC 반응적인 보고 유전자인 pAP1-fos-Luc을 5㎍/3Ｘ10^5 cells의 농도로 transfection시켰다. 이 transfected cell line에 CCR5의 ligand인 MIP1-β를 0-250ng/ml의 농도로 37℃에서 12시간동안 처리하였을 때 용량에 의존적인 루시퍼라제의 활성증가를 관찰할 수 있었다. CCR5의 다른 ligand들인 RANTES와 MIP1-α도 유사한 용량-반응 관계를 보였다. Anti-CCR5 antibody를 처리한 후 RANTES, MIP1-α, MIP1-β에 의한 루시퍼라제의 활성을 유도하였을 때 활성도가 처리하지 않은 수준으로 떨어졌다. 이러한 연구를 토대로 PKC 반응적인 보고 유전자를 이용한 reporter assay를 케모카인의 시험관내 시험법으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.