Baculovirus체계에 의한 ICA512bdc/IA-2단백질의 발현과 제1형 당뇨병 환자에서 이를 이용한 ICA512/I-A-2 자가항체 측정

Abstract

ICA512/IA-2는 tyrosine phosphatase 연관 단백질로 이에 대한 자가항체가 제1형 당뇨병의 진단과 발병 예측에 대한 주요 면역학적 표지자들 중의 하나이다. ICA512bdc/IA-2는 ICA512/IA-2 단백질의 C-말단쪽 724개의 아미노산으로 구성된 단백질로 이 단백질을 항원으로 이용한 검사가 ICA512/IA-2 자가항체 검출의 민감도를 향상시키므로 ICA512/IA-2 자가항체 측정에 주로 이용되고 있다. ICA512bdc/IA-2 단백질은 박테리아 발현체계나 시험관내 전사와 해독(in vitro transcription and translation)으로 주로 발현되고 있다. 그러나 대장균에서 만들어진 단백질은 당화나 인산화같은 해독후 과정이 일어나지 않으므로 해독후 과정이 일어나는 단백질의 검출에서는 민감성이 떨어진다. 또한, 시험관내 전사와 해독으로 발현된 단백질은 양이 적으므로 동위원소를 사용해서 자가항체를 검출해야하고 단백질 발현때마다 해독의 효율성이 달라지는 문제점이 있다. 반면, baculovirus 발현체계는 해독후 과정이 정확하게 일어나므로 면역학적으로 활성이 있는 단백질을 대량으로 생산할 수 있다. 그러므로 본 연구는 유핵세포 발현체계인 유전자 재조합 baculovirus 체계를 이용하여 ICA512bdc/IA-2 단백질을 발현시킨 후 제1형 당뇨병 환자의 혈청에서 ICA512/IA-2 자가항체를 검출하고자 시행되었으며 결과를 요약하면 아래와 같다. 1. ICA512bdc/IA-2 cDNA를 6개의 histidine track이 있는 pAcHLT-C 벡터에 클로닝한 후 ICA512bdc/pAcHLT-C 플라즈미드로 대장균 세포를 형질전환시켰다. 2. ICA512bdc/pAcHLT-C 플라즈미드와 바이러스 DNA에 치명적인 결손이 있는 선상화된 baculovirus DNA를 Sf9 세포에 동시에 유전자 이입시켜 ICA512bdc/IA-2 cDNA를 가지는 유전자 재조합 baculovirus를 제작했다. 3. 유전자 재조합 baculovirus로 Sf9 세포를 감염시켜 4일 후 수확하고 C-말단에 6개의 histidine 잔여기를 가진 ICA512bdc/IA-2 단백질을 니켈 친화력 크로마토그래피법으로 정제하였다. 4. 정제한 유전자 재조합 ICA512bdc/IA-2 단백질을 8% SDS-PAGE로 분리하여 PVDF로 전기이동시킨 후 제1형 당뇨병 환자의 혈청에서 이 단백질과 반응하는 자가항체가 존재함을 확인했다. 5. 제1형 당뇨병 환자의 23%에서 ICA512/IA-2 자가항체가 양성이었으며 ICA512/ IA-2 자가항체가 양성인 환자의 당뇨병 발병연령이 음성인 환자보다 낮았다. 당뇨병의 유병기간이 5년 이하인 환자들 중에서는 발병연령이 15세 이하인 환자의 양성률이 58%로 발병연령이 15세를 초과한 환자의 5%에 비하여 높았다. 결론적으로 유전자 재조합 baculovirus 체계를 이용하여 면역학적으로 활성이 있는 ICA512bdc/IA-2 단백질을 얻었으며, 향후 이 단백질을 제1형 당뇨병 환자에서 ICA512/IA-2 자가항체 측정에 이용할 수 있을 것으로 생각한다. ; Autoantibody to islet cell antigen(ICA)512/IA-2, a tyrosine phosphatase-like protein, is one of the major autoimmune markers for both diagnosis and prediction of type 1 diabetes. ICA512bdc/IA-2 protein is composed of 724 amino acids at carboxyterminus of ICA512/IA-2 protein, and the assay adopting this protein as an antigen is widely used for the measurement of autoantibody to ICA512/IA-2 because it improves the sensitivity of detection of autoantibody to ICA512/IA-2. ICA512bdc/IA-2 protein has been expressed mainly by bacterial expression system or by in vitro transcription and translation. Since post-translational modification such as glycation or phosphorylation does not occur in the recombinant protein expressed in E. coli, the sensitivity is decreased in the detection of the protein with which post-translational modification is required. In addition, the amount of protein expressed by in vitro transcription and translation is small, so that the test should be associated with isotope and its efficiency of the translation depends on the time of protein expression. On the other hand, large amount of immunologically active protein can be produced in baculovirus expression system due to the exact occurance of post-translational modification. In this study, the recombinant baculovirus system was used for the expression of ICA512bdc/IA-2 protein, which is an eukaryotic expression system, and then serum of type 1 diabetes was examined to detect autoantibody to ICA512/IA-2. The obtained results were as follows: 1. ICA512bdc/IA-2 cDNA was cloned into the baculovirus expression vector pAcHLT-C, which has six consecutive histidine residues, and E coli cells were transformed with this plasmid ICA512bdc/pAcHLT-C. 2. Recombinant baculovirus containing the ICA512bdc/IA-2 cDNA was produced by the method that the plasmid ICA512bdc/pAcHLT-C was cotransfected into Sf9 cells with linearized baculovirus DNA including a lethal deletion of the virus DNA. 3. The infected Sf9 cells with recominant baculovirus were harvested after 4 days and the recombinant ICA512bdc/IA-2 protein with six consecutive histidine residues at its C-terminus was purified by an affinity Ni-NTA agarose. 4. The purified recombinant ICA512bdc/IA-2 protein was seperated by 8% SDS- PAGE and electroblotted onto PVDF. The existence of autoantibody which reacted with this protein was confirmed in type 1 diabetic sera. 5. The autoantibody to ICA512/IA-2 was detected in 23% of type 1 diabetes, and the age at diagnosis was significantly lower in the patients with anti- ICA512/IA-2 antibodies. Among the patients with disease duration less than or equal to 5 year, the positivity of autoantibody to ICA512/IA-2 was 58% in the patients of which age at diagnosis was less than or equal to 15 and it is considerably higher than 5% of the patients with age at diagnosis over 15. In conclusion, the immunologically active ICA512bdc/IA-2 protein was expressed efficiently in Sf9 cells using baculovirus expression system. This purified protein will probably be employed as a detection method of autoantibody to ICA512/IA-2 in type 1 diabetes hereafter.