자궁경부암 세포주에서 EGF와 TGF-α가 세포 유착 및 E-cadherin과 EGF 수용체의 발현변화에 미치는효과

Abstract

암세포의 침윤 및 전이는 암세포의 기저막 침투에 의해 생기며 세포간 유착이 소실되고 기저막이 분해되어 기저막 안으로 암세포가 이동이 되는 과정을 말한다. 이러한 과정에서 전이성 암세포에는 표현형의 불안정성, 유착 성질의 변화 등이 나타난다. 침윤성 상피암은 상피세포의 분화가 안되고 세포간 유착이 감소하여 암세포의 침윤성이 증가하며 세포간의 유착물질인 E-cadherin의 발현이 감소된다고 한다. 또한 상피성장인자(epidermal growth factor, 이하 EGF로 약함), 변형성장인자(transforming growth factor-α , 이하 TGF-α 로 약함) 등과 같은 성장인자(growth factor)와 이들 수용체(epidermal growth factor receptor, 이하 EGFR로 약함)의 과발현이 침윤성 폐암, 식도암 등에서 관찰된다고 하였으며 이들 성장인자도 침윤성 암세포의 증식에 관여하는 것으로 알려졌다. 이에 본 연구는 자궁경부암의 침윤 및 전이과정에 유착물질과 성장인자, 그 수용체가 어떠한 작용을 하는 지 알아보고자 하였다. 자궁경부암 세포주를 배양하여 암세포의 형태변화를 관찰하고 EGF, TGF-α 등의 성장인자를 첨가 배양하여 암세포의 형태적 변화와 E-cadherin의 발현변화와 EGFR, 활성화된 EGFR의 발현을 관찰하여 자궁경부암의 침윤 및 전이과정에서의 세포간 유착 물질인 E-cadherin과 성장인자, 수용체의 역할을 규명하고자 하였다. 연구 방법은 자궁경부암 세포주, CaSki, SiHa, ME-180, HeLa, HT-3, C-33A 세포주를 배양하여 암세포 형태변화를 관찰하였고, E-cadherin, EGFR 등은 western blotting 방법으로 검출하였다. 이 중 E-cadherin이 발현되는 CaSki, HT-3, ME-180 세포주에 EGF와 TGF-α를 시간별로 처리하였고 일정시간동안 EGF와 TGF-α를 농도별로 처리하여 암세포의 형태학적 변화를 관찰하였고 동시에 EGF, TGF-α 처리 후의 시간별, 농도별로 E-cadherin, EGFR, activated EGFR 변화를 western blotting 방법으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 자궁경부암 세포주 중 CaSki, ME-180, HT-3 세포주는 상피성 세포형태로 세포끼리 서로 접촉하며 자라는 양상을 보인 반면 C-33A, HeLa, SiHa 세포주는 세포가 흩어져서 자라는 양상을 나타내었다. 서로 접촉하며 자라는 양상을 보인 CaSki, ME-180, HT-3 세포주에서는 120 kDa E-cadherin의 발현과 170 kDa EGFR의 발현이 동시에 관찰되었다. 2. 이 들 세포주에서 EGF와 TGF-α를 시간차이에 따라 처리하였을 때 세포형태는 섬유모세포형으로 변하였으며 농도차이에 따라 처리시에도 농도의 증가에 상관없이 세포가 섬유모세포형으로 변한 상태로 유지되었다. 3. EGF, TGF-α를 시간별로 처리하였을 때 시간이 길어짐에도 E-cadherin의 감소는 거의 관찰되지 않은 반면 EGFR은 감소하였고 activated EGFR은 30분-1시간까지 증가하다가 급격히 감소하는 양상을 보였다. 4. 배양 1일째 EGF와 TGF-α를 농도차이에 따라 처리한 결과 농도가 증가할 때 CaSki, ME-180, HT-3 세포주에서 E-cadherin은 약간 감소한 반면 EGFR는 현저히 감소하였다. 이상의 연구 결과 자궁경부암의 침윤 및 전이 과정에는 E-cadherin의 감소보다는 E-cadherin의 기능변화가 중요하며 EGF, TGF-α 등의 성장인자 자극에 의한 EGFR의 변화, 특히 tyrosine phosphorylation에 관여하는 activated EGFR의 작용이 자궁경부암의 침윤을 유도하는 신호 전달에 중요하다고 생각된다. 앞으로 자궁경부암의 침윤 및 전이에 중요한 역할을 할 것으로 예측되는 E-cadherin 기능을 조절하는 결합 단백질이나 수용체의 작용, E-cadherin 외에 다른 유착인자나 다른 성장인자 등에 대한 연구가 계속되어야 할 것으로 생각된다. ; Invasive squamous cell carcinoma is known to have undifferentiated epithelial cell, decreased cell adhesion and increased invasiveness of tumor cell and decreased expression of cell adhesive factors known as E-cadherin. And also, the over-expression of growth factor receptors, such as EGF receptor (EGFR), was observed in invasive lung cancer and esophageal cancer. These growth factor receptors are known to be involved in the proliferation of invasive tumor cells. The purpose of this study was to determine the effect of E-cadherin, growth factors, and their receptor in the invasion and metastasizing process of cervical cancer. Observation of morphological change of tumor cell, the change of expression of E-cadherin, and the expression of EGFR and the activated EGFR after adding growth factors such as EGF, TGF-α to the culture media was done. Among the cervical cancer cell lines, CaSki, SiHa, ME-180, HeLa, HT-3 and C-33A cell lines were cultured and observed for morphological change of tumor cell. A western blot analysis was performed for detecting E-cadherin, EGFR and activated EGFR. The cervical cancer cell cultures were treated with varying doses of EGF and TGF-α (0, 3, 10, 30, 100 ng/ml) and different time duration (0, 10 min, 20 min, 30 min, 1 hr, 2 hr, 4 hr, 8 hr, 24 hr) and the change in cancer cell line morphology and change in E-cadherin, EGFR and activated EGFR expression were studied. The results were : 1. CaSki, HT-3, and ME-180 cell lines showed epithelial contact growth, while SiHa, HeLa and C-33A cell lines showed fibroblastoid growth. 2. Through western blot analysis, E-cadherin 120 kDa band and EGFR 170 kDa band were expressed in CaSki, HT-3 and ME-180 cell line, which showed epithelial contact growth. 3. In these 3 cell lines, expression of E-cadherin did not decrease with time dependent manner. 4. Expression of EGFR decreased and activated EGFR expression increased in 30 minutes to 1 hour but decreased subsequently. 5. When the cell cultures were treated with EGF and TGF-α for 24 hours, there was a decrease in EGFR expression and slighter decrease in E-cadherin in a dose dependent manner. 6. EGF and TGF-α changed cell morphology to fibroblastoid growth in time dependent manner, however fibroblastoid cell morphology was not effected by an increase in dosage. In conclusion, this study showed that the change in the activity of E-cadherin is more important in the invasion and metastasis of cervical cancer rather than the decrease of E-cadherin. The change of EGFR resulting from stimulation of growth factors such as EGF, TGF-α, especially the function of activated EGFR associated in tyrosine phosphorylation is important in the signal transmission of inducing invasion of cervical cancer cell. Further studies concerning E-cadherin and the other adhesive factors and growth factors, binding proteins, receptor activity regulating the function of E-cadherin which plays an important role in the invasion and metastasis of cervical cancer must be encouraged in the future.