Quinone성 약물에 의한 간독성 유발기전에 관한 연구 : Butylated hydroxyanisole에 의한 보호기전

Abstract

This study reports the results of experiments conducted on the biochemical protective mechanisms provided by butylated hydroxyanisole (BHA) against the hepatotoxicity caused by quinones in general as they undergo biotransformation in aerobic cells. As the hepatotoxic model quinone compound, we have selected the oxidized dichlorophenol indophenol (DCPIP), a quinone0imine compound, which after entering aerobic liver cells undergose either a one electron reduction metabolism producing the toxic DCPIP radical or a two electron reduction metabolism forming the non-toxic reduced DCPIP. While the toxic DCPIP radical, unless detoxified by conjugation with reduced glutathione (GSH), is reoxidized back to the oxidized DCPIP producing superoxide anion in aerobic cells, the nontoxic reduced DCPIP is readily conjugated to form the water soluble glucuronide and sulfates esters and eliminated from the cell. Both the superoxide anion binds covalently with cellular macromolecules such as proteins, RNA and DNA and causes hepatocellar toxicities. Butylated hydroxyanisole (BHA) is a phenolic antioxidant used widely as an additive to foods containing lipids to prevent their spoilage by lipid peroxidation. In previous studies, BHA has been found to prevent the formation of cancer by numerous chemical carcinogens and also to protect aerobic liver cells against the toxicities caused by a wide variety of quinones, components of many medicinal compounds. Further studies have found that when rats and mice were fed with diets containing BHA, activities of several conjugation enzymes were increased very markedly. Thus, elevations of the conjugation enzyme activities produced by BHA feeding were considered to be responsible for the BHA dependent protection against the toxic and carcinogenic chemicals. Livers were isolated from rats which have been fed either the normal diet or the BHA diet and then perfused with a medium containing certain toxic concentration of oxidized DCPIP for various durations. While being perfused, perfusates were collected and the extent of hepatotoxicity produced by the infused DCPIP was assesed by measuring the amount of lactate dehydrogenase (LDH, cytosolic enzyme of liver cell) leaking out from the perfused normal and BHA-fed rat livers. At the same time, to determine how and to what extent the infused oxidized DCPIP was being metabolized, the amounts of reduced DCPIP, reduced and glucuronidated DCPIP, and reduced and sulfated DCPIP present in the perfusate were measured. Furthermore, the extent of biochemically determined hepatotoxicity was confirmed by histological assessment of liver damage. Results showed that the livers of BHA-fed rats were much more resistant to hepatic toxicity caused by the infused oxidized DCPIP. Thus, leakage of LDH commenced much later in the BHA-fed rat livers and the amount of LDH leaked form BHA-fed rat livers was much smaller than the amount of LDH leaked from normal diet fed rat liveers. Upon light microscopic examination, the histological damage caused by DCPIP infusion in the BHA-fed rat livers was found to be much lighter than the those observed in the normal diet fed rat livers. Upon analysis of perfusates for DCPIP metabolites, the BHA-fed rat livers had much greater rate of production of reduced DCPIP and of glucuronide ester of reduced DCPIP. Thus, BHA feeding has increased the two-electron reduction metabolic capacity and the glucuronidation capacity leading to enhanced rate of detoxification and elimination of the infused oxidized DCPIP, a hepatotoxic quinone compound. The BHA-fed rat liver tissues were analyzed biochemically to determined if the enzyme activities responsible for either the one or two electron reduction of the infused oxidized DCPIP. Results showed that reduction enzyme, was not increased, the activity of NAD(P)H: quinone reductase (QR), the two electron reduction enzyme, was markedly increased. Results also showed that the content of GSH as well as the activity of glutathione S-transferase (GST) were increased markedly. Thus, it appeared that, while the rate of DCPIP radical production was not increased, the rate of detoxifyng the toxic performed DCPIP radical was enhanced. Essentially, BHA-feeding resulted in increasing the rate of two major detoxification pathway for the infused oxidized DCPIP. Namely the production of nontoxic DCPIP involving QR and the elimination of toxic DCPIP radical involving the GSH conjugation with GST. In an effort to determine which one of the two detoxification pathway is more important in the metabolism of infused oxidized DCPIP, selective inhibitors of both detoxification pathways were used. Thus, to inhibit QR selectively, livers were obtained from rate (normal and BHA-fed) pretreated with dicoumarol(DC) and then perfused with oxidized DCPIP as before and the extent of hepatotoxicity produced was assessed. Also, to inhibit the GSH conjugation pathway selectively, livers were obtained from rats pretreated with diethylmaleate (DEM, depleator of performed intracellular GSH) and then perfused with the same concentration of DCPIP and the extent of hepatotoxicity produced was assessed again. Results showed that when rats fed normal diets were pretreated either with DC or MSO plus DEM, hepatotoxicity produced upon infusion of the same concentration of DCPIP was much greater and occurred much faster. Livers of BHA-fed rats were much more resistant to the hepatotoxicity inducible with infusion of DCPIP, Furthermore, in both types of rat livers (normal and BHA-fed), when the toxicity produced after pretreatment DC (blockade of QR) were compared with those produced after pretreatment with MSO plus DEM (blockade of GSH conjugation), the toxicity produced upon blocking the GSH conjugation pathway was more extensive than that produced by blocking the two electron reduction pathway. As the results so far have shown, the hepatotoxicity caused by infusing DCPIP, a model quinone compound, is causatively related with the biotransformation of quinone in aerobic cells which produce the toxic epoxides, semiquinone radicals, and superoxide anion by redox cycling metabolism. Furthermore, the protection provided by BHA pretreatment was found to be due to marked elevation of the activities of enzymes involved in their detoxification. Thus, in an effort to determine whether the elevated activities of the protective enzymes produced by BHA pretreatment was due either to their activation or to their induction, we have determined the levels of mRNA coding for the protective enzymes in liver tissues following the BHA pretreatment. The enzymes whose mRNA levels have been measured are GST, epoxide hydrolase (EPH), QR and superoxide dismutase (SOD). In determining the mRNA levels coding for these enzymes, as some of these enzymes are made up with isozymes, the cDNAs of various isozymes were used as probes. Furthermore, as there are close sequence homologies between the cDNAs coding for several of thses isozymes and made it difficult to use the cDNA as probes, we have subcloned the 3 -untranslated regions from the cDNAs which have much reduced sequence homologies. Upon feeding rats with BHA-diet for various durations, the mRNA was isolated from liver tissues and blotted with the subcloned cDNAs of (Ya, Yb_1, Yb_2, Yc and Yp subunit), EPH, QR and SOD (CuZn and Mnsubunit). Results showed that the hepatic levels of mRNAs coding for these protective enzymes were increased by 3 to 5 days after feeding the BHA containing diet. Depending on specific enzymes, the levels of some mRNA began to increase by 3 days and the levels of other mRNA began to increase by 5 days of BHA feeding. In most cases, maximal level of mRNAs were detected by 10 days and were maintained up to 21 days as long as the BHA-diet was being fed. To determine how fast the hepatic levels of mRNAs coding for the protective enzymes were increased upon contact with BHA and at what concentration of BHA, livers isolated from rats fed normal diet were infused with varying concentrations of BHA and for varying durations. The infused BHA concentrations varied from 0, 1x10^-6, 1x10^-5, 5x10^-5, 1x10^-4 to 5x10^-4 M and the duration of infusion varied from 1.5, 3, 6, and 8 hours. Results agains showed that depending on specific enzymes, the levels of some mRNAs (GST Ya and GST Ybs subunit) increased by as early as 1.5 hours infusion of 100 μM BHA and the levels of other mRNA (QR and CuZn SOD subunit) began to increase only after 6 hours infusion of BHA. Furthermore, the levels of some mRNAs (GST Yp subunit) increased upon infusing 1x10^-5 M of BHA for 6 hours, the others required infusion of 1x10^-4 M concentration of BHA. After observing the increase in the levels of various mRNAs coding for the enzymes responsible for detoxification of several toxic metabolites produced upon redox cycling metabolism of quinones in aerobic cells, we needed to determined whether the increase in the mRNA level is due either to their enhanced transcription rate or to reduced degradation rate. Results of the nuclear run-off assay indicated that the induction of mRNAs produced by the BHA feeding was due to enhanced rate of transcription or to transcriptional activation. In summary, the results of present study indicate that BHA protects aerobic cells from the quinone toxicity. This protective effect is produced by the marked enhancement in the rate of transcription of the DNA segments coding for the mRNAs of various detoxification enzymes that responsible for detoxification of toxic metabolites arising from redox cycling metabolism of quinones. ; 본 연구에서는 butylated hydroxyanisole (BHA)이 대표적인 간독성물질인 quinone의 간독성 유발을 억제하는 기전에 대하여 BHA 식이투여에 의한 간세포내 약물대사효소들의 활성도 증가와 연관지어 세포와 분자수준에서 체계적으로 규명하고자 하였다. 이를 위하여 세포수준에서는 첫째로, BHA를 흰쥐에 식이투여한 후 적출관류간실험법을 이용하여 quinone계 모델약물인 2,6-dichlorophenol indophenol (DCPIP)을 적출한 간에 관류시켜 DCPIP의 대사양상과 간독성 유발양상을 동시에 관찰하였으며, 아울러 간조직의 조직학적 손상 정도를 비교하였다. 둘째로, quinone의 해독대사 경로 중 어느 경로가 BHA의 간독성 보호작용에 크게 기여하는 가를 알아보기 위하여 각 경로의 저해제나 고갈제를 진처리한 후 DCPIP에 의한 간독성 유발양상의 변화를 관찰하였다. 셋째로, BHA에 의한 quinone 대사에 관여하는 약물대사 효소들이 존재하는 간세포 소포체의 지질조성의 변화를 관찰하였다. 그리고 분자 수준에서는 BHA에 의한 이들 해독효소의 활성도 증가가 간세포내의 mRNA의 증가에 기인한 것인가를 관찰하기 위하여 BHA를 식이투여했을 때와 직접 적출한 간에 BHA를 다양한 농도 및 시간동안 관류시켰을 때의 mRNA 양을 측정하였으며, 이러한 mRNA 량의 증가가 mRNA의 생성속도의 증가에 기인한 것인가를 관찰하기 위하여 nuclear run-off assay를 실시하였다. 첫째, BHA를 흰쥐에 식이투여 한 후 적출관류간실험법(isolated perfused liver techniqe)을 이용하여 80μM DCPIP를 130분 동안 관류시키면서 관류액 내로 배출된 DCPIP의 대사체 (glucuronide 포합체, sulfate 포합체, 환원체)를 측정하여 DCPIP의 대사양상을 관찰하였고, 동시에 관류액내에 유출된 lactate dehydrogenase (LDH)의 활성도를 측정하여 DCPIP에 의한 간독성 유발정도를 측정하였다. DCPIP의 대사양상을 관찰하였을 때 DCPIP의 총대사량에서 glucuronide 포합체량과 총환원량이 차지하는 비율은 BHA군이 정상군에 비하여 각각 19%와 22% 정도 크게 나타났다. 그리고 BHA군에서는 정상군에 비하여 LDH는 30분 정도 늦게 유출되기 시작하였고 최대유출량도 정상군의 약 20% 정도 수준으로 매우 적었다. 또한 DCPIP를 일정시간 관류시킨 후 간조직의 손상정도를 광학현미경으로 관찰하였을 때 BHA 식이투여에 의하여 DCPIP에 의한 간조직의 손상이 감소되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 실험결과에 의하여 BHA 식이투여가 DCPIP의 대사경로 중 해독경로를 크게 증가시켜 DCPIP에 의한 간독성 유발이 감소되었음을 세포수준에서 알 수 있었다. 둘째, quinone 해독기전에 관여하는 대사경로 즉 이전자전달해독경로와 일전자전달해독경로 중 어느 경로가 DCPIP의 간독성 유발을 효과적으로 억제하며, DCPIP의 간독성 유발에 대한 BHA의 보호작용에 어느 해독경로가 더 중요한 역할을 하는가를 조사하기 위하여 각 해독경로를 인위적으로 저해한 후 적출관류간실험법을 이용하여 DCPIP에 의한 간독성 유발정도를 비교하였다. NAD(P)H:quinone reductase (QR)가 관여하는 이전자전달 해독경로의 역할을 관찰하기 위하여 QR의 선택적 저해제인 dicoumarol(DC)을 전처리하였으며, glutathione S-transferase (GST)와 glutathione (GSH)이 관여하는 일전자전달해독경로의 역할을 관찰하기 위하여는 GSH의 합성저해제인 methionine sulfoximine (MSO)과 GSH 고갈제인 diethylmaleate (DEM)를 함께 전처리하여 GSH를 고갈시켰다. 80μM DCPIP를 관류시켰을 때 정상군에서는 MSO와 DEM군이 DC군 보다 LDH가 10분 정도 빨리 유출되기 시작하였으며 최대유출량도 약 15% 정도 많았고, DC군은 대조군보다 LDH는 30분 정도 빨리 유출되기 시작하였으며 최대유출량도 4배 정도 많았다. 그러므로 정상군에서는 GSH와 QR 모두가 quinone의 간독성 유발을 억제하는 데 중요한 역할을 하지만 GSH가 QR보다 더욱 효과적으로 작용함을 알 수 있었다. 한편 BHA군에서는 MSO와 DEM군이 DC군 보다 LDH가 유출되기 시작하는 시간은 10분 정도 빨랐으나 최대유출량은 차이가 없었으며, 양군다 대조군보다는 LDH가 유출되기 시작하는 시간이 50~60분 정도 빨랐고 최대유출량도 10배 이상 많았다. 따라서 BHA군에서도 GSH와 QR 모두가 quinone의 간독성 유발을 억제하는 데 중요한 역할을 하며, GSH가 더 효과적이긴 하지만 정상군 보다는 QR의 역할이 크게 증대되었음을 알 수 있었다. 그리고 정상군과 BHA군에서 각 경로의 저해제를 전처리한 경우에는 BHA의 간독성 보호작용이 크게 감소되는 것으로 미루어 이들이 BHA의 간독성 보호작용에 크게 기여하는 것을 간접적으로 알 수 있었다. 셋째, BHA가 DCPIP에 의한 간독성 유발을 억제하는 작용에 QR이나 GSH의 다른 약물대사효소가 관여되었는가를 관찰하기 위하여 적출관류간실험법을 이용하여 모델약물로 7-ethoxycoumarin (EC)와 7-hydroxycoumarin (HC)를 관류시켜 BHA에 의한 phase I 대사와 phase II 대사 관련 효소들의 활성도 변화를 동시에 측정하였다. 그리고 적출관류간실험법을 이용하여 측정할 수 없는 약물대사효소들의 활성도의 간세포 세포질과 microsome 분획을 사용하여 in vitro로 측정하였다. 적출관류간실험법으로 실험하였을 때 BHA군이 phase I 대사에 의한 최대산화속도와 phase II 대사의 최대 sulfate 포합속도는 정상군과 비교하였을 때 유의적인 차이가 없었으나, 최대 glucuronide 포합속도는 최소한 2.5배 정도 증가되었으며, 약물을 해독시킬 수 있는 능력을 나타내는 예비포합능력은 약 3배 정도 증가되었다. 그리고 여러 약물대사효소 활성도를 in vitro로 측정하였을 때 BHA 식이투여에 의하여 일전자전달독성경로 관련효소 중 NADPH-cytochrome P_450 reductase의 활성도와 cytochrome P450의 함량에는 변화가 없었으나 cytochrome b_5 함량은 30% 정도 증가되었다. 반면에 quinone 대사과정시 해독에 관련되는 효소들 중 GST 및 QR의 활성도는 각각 약 2.3배 및 3.2배 정도 증가되었으며, SOD의 활성도에는 유의적인 변화가 없었다. 따라서 이러한 결과로 quinone의 간독성 유발에 대한 BHA의 간보호작용은 quinone의 대사과정에서 독성대사물을 만드는 경로의 효소의 활성도에는 변화없이 단지 해독경로만이 증가됨에 기인된 것임을 알 수 있었다. 넷째, 약물대사 효소가 존재하는 간세포 소포체의 지질조성에 의하여도 효소 활성도가 변할 수 있으므로 BHA에 의한 소포체의 지방산 조성의 변화를 분석하였다. 통계적 유의성은 없으나 BHA군이 정상군에 비하여 간세포의 소포체를 구성하는 지방산 중 arachidonic acid의 구성비율이 약간 높게 나타났으며, oleic acid의 비율은 약간 낮았다. 그러나 전체적으로 P/M/S 비율과 double bond index는 유의적인 차이가 없었다. 이러한 결과로 BHA가 간소포체분획의 지방산 조성에 유의적인 변화를 나타내지 않음을 알 수 있었다. 이상과 같이 BHA의 간보호작용이 간세포내 quinone 대사관련 해독효소들의 활성도 증가에 기인한 것임을 세포수준에서 관찰한 결과를 바탕으로 BHA에 의한 해독효소의 활성도 증가가 이들 효소를 coding하는 mRNA량의 증가에 의한 것인가를 확인하고자 BHA에 의한 간세포내 이들 효소들의 mRNA량의 변화와 mRNA 생성속도의 변화를 분자생물학적 방법을 이용하여 조사하였다. 이를 위하여 quinone 대사과정의 독성대사물인 semiquinone radical의 생성억제 및 생성 후의 제거작용에 관여하여 free radical에 의한 세포독성을 방지하는 데 중요한 효소들인 glutathione S-transferase (GST), epoxide hydrolase (EPH), quinone reductase (QR), superoxide dismutase (SOD)의 간세포내 mRNA량 을 측정하였다. 특히 이들 효소 중 GST는 GST 여러 subunit 유전자를 구성하는 α계통의 Ya와 Yc, μ계통의 Yb_1과 Yb_2, 및 π계통의 Yp 등 5가지 종류 subunit의 mRNA를 측정하였으며, SOD는 CuZnSOD와 MnSOD 등 2가지 종류의 isozyme의 mRNA를 측정하였다. GST subunit의 α계통인 Ya와 Yc, μ계통인 Yb_1과 Yb_2의 cDNA는 같은 계통간에는 상호 핵산서열의 유사성 (sequence homology)이 매우 높아 각 subunit의 mRNA만을 선택적으로 측정하기가 힘들므로 서열유사성이 낮은 3 -untranslated region만을 subclonig하여 각각의 subunit을 선택적으로 측정할 수 있는 probe으로 사용하였다. Quinone의 간독성 유발에 대한 BHA의 간 보호작용에 관련된 quinone 대사 해독효소의 활성도증가와 mRNA 수준 증가와의 상관관계를 관찰하고자 먼저 BHA의 식이투여 기간에 따른 각 해독효소의 mRNA의 증가를 측정하였다. BHA를 흰쥐에 3, 5, 7, 20, 14, 및 21일간 식이투여한 후 mRna 수준을 측정하였을 때 GST Ya, Yb_1, Yb_2, Yc 및 Yp subunit mRNA와 EPH, QR 및 MnSOD의 mRNA는 효소 종류에 따라 식이투여 3일에서 5일경부터 증가되기 시작하였으며, 식이투여 10일에서 21일경에 증가량이 최대에 이르렀으나, CuZnSOD의 mRNA는 증가되지 않았다. 한편 생체내의 다른 장기 및 호르몬 등의 영향 없이 간세포 자체내에서 어느정도의 BHA 농도에서 mRNA가 증가되는가를 관찰하기 위하여 다양한 농도의 BHA(0, 1x10^-6, 1x10^-5, 5x10^-5, 1x10^-4, 및 5x10^-4 M)를 적출한 간에 6시간 동안 관류시켰다. 이때 GST Ya, Yb_1, Yb_2, 및 Yc subunit mRNA와 EPH, QR, CuZnSOD 및 MnSOD의 mRNA는 주로 1x10^-4 M에서 증가되었으나, GST Yp subunit mRNA는 5x10^-5 M에서 부터 증가되기 시작하였다. 그리고 대부분 효소의 mRNA는 최대 증가량이 약 5-10배 정도에 달했으나 OR의 mRNA는 약 30배 정도가 증가되었으며, CuZnSOD는 약 2배정도만 증가되었다. 이밖에 quinone 독성에 대한 해독관련 효소들의 mRNA량이 BHA에 의하여 얼마나 빨리 증가되기 시작하는가를 관찰하기 위하여 100μM의 BHA를 1.5, 3, 6, 및 8시간 동안 관류시켰을 때 GST의 Ya, Yb_2와 Yp subunit 및 EPH, MnSOD 경우에는 1.5시간 관류시켰을 때부터 mRNA가 증가되기 시작하였으나, Yb_1의 경우에는 3시간, QR이나 CuZnSOD의 경우에는 6시간 동안 BHA를 관류시켰을 때부터 mRNA량이 증가되기 시작하였다. 이러한 결과는 해독효소의 종류에 따라 mRNA가 증가되기 시작하는 시간이 다르다는 것을 나타내었다. 다음에는 BHA에 의한 해독효소들의 mRNA량의 증가가 mRNA 생성속도 증가에 의한 것이나를 관찰하기 위하여 muclear run-off assay를 실시한 결과, BHA에 의하여 mRNA의 합성속도가 증가됨을 관찰하였다. 그러므로 BHA에 의한 mRNA의 증가는 전사단계의 활성화 (transcriptional activation)에 기인함을 관찰하였다. 본 연구결과를 통하여 BHA가 quinone의 간세포독성 유발을 억제하는 기전은 BHA의 식이투여로 인하여 세포수준에서는 quinone 대사과정에서 일전자독성화과정에 관련된 효소들의 활성도에는 변화 없이 해독과정에 관련된 효소들의 활성도를 크게 증가되었기 때문이며, 이러한 효소 활성도의 증가는 분자수준에서 간세포내 이들 효소를 coding하는 mRNA량의 증가에 의한 것이며, mRNA의 증가는 BHA에 의하여 mRNA 생성속도가 증가된 것에 기인한 것임을 체계적으로 관찰하였다.