Methamphetamine의 면역분석법에 관한 연구

Abstract

To improve the sensitivity and the specificity of the methamphetamine (MA) immunoassay, various parameters which affect the immunoassay performance were investigated with respect to the immunogen, the antibody purification method, the competitor, as well as the assay format. Affinities of antibody for the analyte and the competitor were also measured to examine their effects on the sensitivity of the assay. An Nn-4-aminobutyl dervative of MA (4-ABMA) was conjugated with bovine serum albumin (BSA) and keyhole limpet hemocyanin(KLH), and used as immunogens. Three kind of MA antisera were produced from goats: anti-4-ABMA-BSA(L) and anti-4-ABMA-BSA(H), which represented low and high molar ratio of hapten/protein in the 4-ABMA-BSA immunogen respectively, and anti-4-ABMA-KLH. All the antisera were purified by affinity chromatography with various ligand: 4-ABMA-BSA, 4-ABMA-KLH, 4-ABMA-ovalbumin (4-ABMA-OVA), MA, 4-ABMA, amphetamine, and protein G. The purified MA antibodies were characterized by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), fluorescence polarization immunoassay (FPIA), capillary electrophoresis-laser induced fluorescence(CE-LIF)-based immunoassay and dry immunochromatographic assay. Various competitors were also prepared to examine their effects on the sensitivity and specificity of the assay: 4-ABMA-BSA, 4-ABMA-KLH, 4-ABMA-OVA, 4-ABMA-horseradish peroxidase (4-ABMA-HRP), 4-ABMA-biotin, 4-ABMA-fluorescein isothiocyanate (4-ABMA-FITC), MA-FITC, and amphetamine-FITC. Immunoassay results were varied depending on the competitors, assay formats and the ligands of the affinity columns used Among the purified antibodies by immunoaffinity chromatography, the antibodies from MA and amphetamine columns gave more sensitive results in ELISA with 4-ABMA-OVA than others in each antiserum. They also showed high affinity for benzphetamine, a drug of abuse, resulting in the simultaneous detection of MA and benzphetamine. Particularly, the antibody obtained from the amphetamine column gave improved cross-reactivity results than that obtained from the MA column without loss of the high sensitivity; the lowered cross-reactivity to methylephedrine and the elevated one to amphetamine. These sensitivity and cross-reactivity results were closely related with the structure of the ligand of the affinity column used. Studies on effects of the competitor and the assay format on the performance of the assay leaded to development of the new sensitive immunoassay. The FITC tracer, which is usually used in the fluorescence immunoassay, was applied to ELISA and CE-LIF-based immunoassay resulting in high sensitivity. In ELISA with 4-ABMA-FITC, some antibodies showed even 102~103 times as sensitive as in ELISA with 4-ABMA-OVA.Dry immunochromatographic assay was also developed by our own technology based on ELISA results. To investigate the relation between the assay sensitivity and antibody affinities, the affinities of the antibody for the analyte of MA and for the competitor of 4-ABMA-OVA were measured by biomolecular interaction analysis(BIA) technology. The results indicated that the relative affinity of the antibody for the two ligands, the analyte and the competitor, rather seemed be a major factor which affects the assay sensitivity than the affinity for the analyte only. The results obtained from those studies revealed that the sensitivity and the specificity were closely related with the chemical structures of the immunogen, the competitor, and the ligand for the affinity purification. The results also indicate that the purification method of polyclonal antibodies has great potential to improve the assay performance. The study of the epitope site may be also used as valuable information in the design or preparation of the immunogen or affinity column ligand: in the direction of the structure of the analyte of interest and opposite to the structure of cross-reactants which may interfere the assay results.

Keywords: methamphetamine, antibody purification method, competitor, ELISA, FPIA, CE-LIF, dry immunochromatographic assay, biosensor, sensitivity, specificity ; Methamphetamine(MA)은 빈번히 남용되어 많은 사회 문제를 일으키는 약물중의 하나로 그 복용 여부의 감별은 주로 요 시료 중의 MA를 검출함으로써 이루어진다. MA의 검출은 기기 분석적인 방법으로 흔히 이루어지나. 약물 모니터링에는 손쉽고 결과가 빠른 면역분석법이 주로 사용되고 있다. 면역분석법에 사용되는 항체는 화학적 구조가 비슷한 물질에 대해 교차반응성을 나타낼 수 있으며 이를 이용하면 관련 물질의 동시 검출이 가능하다. 본 연구에서는 MA 항체를 직접 생산하고 다양한 방법으로 정제한 후 이를 사용하여 면역분석법을 수행하였으며, 이때 면역분석법의 분석감도와 교차반응성에 영향을 미치는 여러 인자에 대해 다양한 분석 시스템을 도입하여 조사를 하였다. 그리고 이를 이용하여 분석감도다 좋으면서 관련 약물을 동시에 검출 할 수 있는 면역분석법을 개발하고자 하였다. 면역분석법에 적합한 항체를 제조하고자 항원의 종류를 변화 시키고, 또 생산된 항체의 정제를 위하여 여러 종류의 ligand를 이용한 immunoaffinity chromatography를 사용하였다. 즉, 항체의 생산을 위하여 MA를 N-(4-aminobutyl) methamphetamine (4-ABMA)으로 활성화시키고 carrier protein으로 bovine serum albumin (BSA)과 keyhol limpet hemocyanin(KLH)을 사용하여 면역원을 합성하였다. BSA 면역원은 molar ratio가 낮은 것과 높은 것의 두 종류로 만들었고, 이를 KLH 면역원과 같이 염소에 주사하여 모두 세 종류의 MA 항혈청을 얻었다. 항혈청의 정제를 위한 affinity chromatography의 ligand로는 4-ABMA-ovalbumin (4-ABMA-OVA), 4-ABMA-BSA, 4-ABMA-KLH, MA, 4-ABMA, amphetamine 및 protein G를 사용하였으며, 정제한 항체를 여러 가지 분석 시스템에 적용하여 ligand가 분석결과에 미치는 영향을 조사하였다. 항체를 이용한 분석 시스템으로는 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), fluorescence polarization immunoassay (FPIA), capillary electrophoresis-laser induced fluorescence (CE-LIF)-based immunoassay 및 dry immunochromatographic assay 등을 이용하였으며, 이 때 competitor로는 4-ABMA-BSA, 4-ABMA-KLH, 4-ABMA-fluorescein isothiocyanate (4-ABMA-FITC), MA-FITC 및 amphetamine-FITC를 합성하여 사용하였다. 사용된 competitor와 분석 시스템에 따라 각 면역 분석법의 분석감도와 교차반응성의 결과가 매우 말라졌으며, 그 결과는 항체를 정제할 때 사용한 immunoaffinity column ligand의 구조와도 연관성이 있었다. MA나 amphetamine column으로부터 정제된 항체들은 4-ABMA-OVA를 competitor로 한 ELISA의 분석결과에서 좋은 분석감도를 보여주었으며, 또 한 마약류 중의 하나인 benzphetamine에 대해 매우 높은 affinity를 나타내어 MA와 benzphetamine의 동시 분석도 가능하게 하였다. 특히 amphetamine column에서 정제된 항체는 분석감도가 매우 좋으면서 ephedrine류에 대한 교차반응성은 낮고 amphetamine에 대한 반응성이 증가되어, 사용된 항체중 가장 좋은 결과를 주었다. 분석 시스템에 따라 사용한 competitor의 분석감도에 미치는 영향이 크다는 것을 밝혔다. 예를 들면 FPIA에서 사용한 4-ABMA-FITC competitor를 CE-LIF에 적용시켰을 때 분석 감도가 FPIA에서보다 낮아지는 것을 관찰하였다. 특히 이 FITC competitor를 ELISA에서 사용하였을 때는 몇몇 항체의 경우 4-ABMA-OVA를 이용했을 때보다 분석감도가 102~103배나 향상되었다. 또한 ELISA의 결과를 토대로 항체와 competitor를 선별하고 자체 기술개발로 현장에서 사용 가능한 dry immunochromatographic strip을 개발하였을 때 그 분석감도와 교차반응성의 결과는 ELISA 결과와 일관성이 있었다. 항체의 analyte와 competitor에 대한 affinity가 분석감도에 미치는 영향을 조사해 보기 위해 biomolecular interaction analysis(BIA) techonology를 이용하여 MA에 대한 affinity와 competitor로 사용된 4-ABMA-OVA에 대한 affinity를 구하였다. 그 값과 ELISA에서 얻어진 분석 감도와의 상관관계를 조사해 본 결과, 항체의 analyte에 대한 단독 affinity보다 analyte와 competitor에 대한 상대적인 affinity가 면역분석법의 감도에 더 중요한 요인으로 작용함을 확인하였다. 이상과 같은 연구결과로 polyclonal 항체를 이용한 haptenic antigen의 면역분석에는 항체의 정제방법과 competitor의 선별이 분석 시스템과 더불어 매우 중요한 인자로 작용하며, 이러한 모든 요인들이 면역원 구조와 affinity column ligand의 구조와 밀접하게 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. 그리고 이러한 결과는 다른 haptenic antigen의 분석법을 확립하는데 유용하게 이용될 것으로 사료된다.

주요어 : methamphetamine, 항체 정제방법, competitor, ELISA, FPIA, CE-LIF, dry immunochromatographic assay, biosensor, 분석감도, 교차반응성