Flavin 동족체인 7-ethylflavin과 8-ethylflavin이 백서 간장 및 뇌세포 monoamine oxidase 활성도와 뇌세포 serotonin 농도에 미치는 영향

Abstract

The effects of 7-ethyl-8-methylflavin (7-Et) and 7-methyl-8-ethylflavin (8-Et) on rat hepatic monoamine oxidase (MAO), brain MAO activity and 5-hydroxytryptamine (50HT or serotonin) in rat brain were investigated. In the study of hepatic MAO activity, kynuramine, a nonphysiological substrate for both A and B type MAO, was used for a spectrophotometric method, and `^14 C-labelled amines were also used for a radiometric procedure for comparison with MAO activity determined by the spectrophotometric method. The rate of change in MAO activity of hepatic mitochondria from rats receiving Rb-def and 7-Et and 8-Et flavin group and 8% in 8-Et flavin group) was observed at the end of 2 weeks. The enzyme activity lasted with slow decrement of enzyme level from 4 weeks to the end of 8 weeks as low as 16% in Rb-def, 18% in 7-Et and 3% in 8-Et flavin group. The trend of decrement of MAO activity when kynuramine was used as a substrate appears to be similar with the small variation of MAO activity when `^14 C-labelled tyramine, dopamine, serotonin and tryptamine respectively were used as substrate. The rate of decay of brain mitochondrial MAO activity in rats receiving each respective flavin was not rapid and severely depressed as the MAO activity we have found in liver mitochondrial MAO of rat during the 8-week experimental period, but a similar tendency of decay of MAO in each group was observed. The potent inhibitory effect of 8-Et flavin on brain MAO was confirmed by the study or the simultaneous measurement of MAO activity in each experimental group. When the reduction of brain MAO activity in rats receiving 8-Et flavin after 6 weeks was approximately 80% of normal and in the same rats the concentration of brain 5-HT showed a 60% increment of that of the normal rats. During the experimental period there is no absolute parallelism between the MAO inhibition and 5-HT increase. However when the reduction of MAO activity reached 80% of normal value, the concentration of 5-HT increased dramatically as much as 60% of normal value. The results so far suggest clearly that 8-Et produces a much more potent inhibitory effect on the hepatic MAO as well as brain MAO in rats. Therefore our present and previous results suggest that 7-Et and 8-Et flavin should bind itself to hepatic, brain MAO apoenzyme in the condition of total absence of riboflavin in these animals, and the holoenzyme is catalytically more inactive when 8-Et flavin bind itself to MAO apoenzyme. ; Flavin adenine dinucleotide (FAD)를 공유결합으로 함유하고 있는 효소에는 몇몇 종류가 알려져 있다. 즉 포유 동물의 mitochondria 내막에 존재하는 succinic dehydrogenase (SDH) (EC 1. 3. 99. 1), 외막에 존재하는 monoamine oxidase (MAO) (EC 1. 4. 3. 4) 그리고 mitochondria matrix에 존재하는 sarcosine dehydrogenase (EC 1. 5. 3. 1)가 알려져 있다(Lambooy와 Shaffner, 1977). 이들 효소들에는 보조효소로써 FAD가 효소 단백질에 공유 결합되어 있다. 본 연구는 riboflavin (Rb) 동족체 7-ethyl-8-methyl-10-(1 -D-ribityl)-isoalloxazine (7-ethyl-8-methylflavin or 7-Et flavin)과 7-methyl-8-ethyl-10-(1 -D-ribityl)-isoalloxazine (7-methyl-8-ethyl flavin or 8-Et flavin)을 Rb대신 백서에 투여하고 이 동족체가 백서 간장 및 뇌 세포내 monoamine oxidase (MAO) 활성도에 어떻게 영향을 미치며 특히 뇌세포에서 뇌기능을 조절하는 중요한 biogenic amine의 하나인 serotonin 양을 정량하여 뇌세포내 MAO 효소 활성과 serotonin 양의 상호 관계를 규명하기 위하여 본 연구에 착수하였다. 간장내 MAO 활성도의 변화를 측정하기 위하여 웅성 백서를 Rb-군, Rb-결핍군, 7-Et flavin군, 8-Et flavin군으로 나누어 해당 식이로 8주간 사육하여 2주 간격으로 효소 활성도를 측정하였으며 효소 활성도 측정은 MAO A 형과 B형의 공통적인 기질로써 알려진 non biogenic amine인 kynuramine을 사용하여 spectrophotometric 방법을 시행했으며 비교목적으로 biogenic amine인 `^14 C-labelled amine들을 기질로 하여 radiometric 방법을 시행하였으며 효소 활성은 n moles substrate oxidized/min/mg protein으로 표시하였다. Kynuramine을 기질로 하여 측정한 각군 백서 간장내 MAO 활성도는 해당 식이 투여 2주후에 이미 급격하게 감소하여 Rb-결핍군, 7-Et flavin군, 8-Et flavin군에서 정상군 효소 활성도의 39%, 35%, 8%를 각각 나타내었으며 해당 식이 투여 8주 후에는 정상군의 16%, 18%, 3%를 각각 나타냄으로써 백서 간장 세포내 MAO 활성도는 7-Et flavin보다는 8-Et flavin에 의해서 강하게 감소되었음을 관찰하였다. 이와 같은 현상은 중추 신경계에 중요한 신경 전달 물질로 알려진 biogenic amine인 serotonin이나 dopamine을 기질로 사용했을 때보다 tryptamine 또는 tyramine을 기질로 사용했을 때에 더욱 뚜렷하게 나타났다. 이러한 사실은 곧 간장 세포에 존재하는 MAO와 중추신경 세포에 존재하는 MAO는 아마도 그 성질이 다를 것이라는 사실을 간접적으로 제시해주는 실험적 증거로 사료된다. 각 실험군 백서에서 L-DOPA(L-3, 4-dihydroxyphenylalanine) 대사 능력을 비교하기 위한 실험에서는 웅성 백서를 위에서와 같이 동일한 방법으로 8주간 사육하여 2주 간격으로 L-DOPA(320mg/Kg of body weight)를 복강내 주사 후 나타나는 각군에서의 백서 사망률을 관찰한 바 8-Et flavin군에서만 해당 식이 4주때 10마리중 모두가 사망하였으며 8주때에도 16마리중 모두가 사망하였으며 Rb-군과 Rb-결핍군 및 7-Et flavin군에서는 거의 모두 회복되는 현상을 관찰했다. 이러한 사실은 뇌세포 MAO 활성이 약 50%로 감소하면 L-DOPA 대사 장애로 인한 치사를 일으키는 한계치로 사료되며 또한 간장내 MAO 의 기능은 정상 조건에서 동물의 생존을 위해서 꼭 필요한 필수 조건이 아니라는 것을 간접적으로 시사하는 것 같다. 뇌세포내 MAO 활성도 변화는 위와 같이 4군으로 나눈 웅성 백서를 6주간 사육하여 kynuramine을 기질로 사용한 spectrophotometric 방법으로 측정했으며 해당 식이 투여 6주 후에 나타난 백서 뇌세포 MAO 활성도는 Rb-결핍군, 7-Et와 8-Et flavin군에서 정상군의 65%, 70%, 20%이었다. 뇌세포내 MAO 활성도 역시 7-Et flavin보다 8-Et flavin,에 의해서 더 강하게 감소되었다. 해당 식이 투여 6주 후에 fluorometric 방법으로 측정한 백서 뇌세포내 5-HT 농도 증가는 8-Et flavin군에서 정상군의 60%, 7-Et flavin군에서 25%의 증가를 보였으며 Rb-결핍군에서는 약간 증가되는 경향을 보였으나 별 의미있는 변화는 없었다. 이러한 사실로 미루어 백서 뇌세포내에 축적되는 serotonin의 농도는 뇌 MAO 활성 감소와 직접적인 상관 관계가 있음을 실험적으로 규명하였다. 이상의 결과와 전 연구자들의 연구 결과를 종합하여 볼 때 7-Et와 8-Et flavin은 간장 세포 및 뇌세포내에서 MAO를 생합성하는 과정에서 Rb 대신 MAO apoenzyme과 결합되어 holoenzyme을 합성하며, 7-Et flavin에 비해 8-Et flavin이 더 강한 MAO 활성 감소 작용기전은 8-Et flavin이 MAO의 pseudo-FAD junction에서 활성군인 8-ethyl기의 α carbon을 이용하여 비정상적인 공유 결합 구조를 형성하므로 초래되는 결과로 사료된다. 또한 이들 flavin 동족체가 간장 및 뇌세포 MAO 활성도에 미치는 영향이 전 연구자들에 의해서 발표된 SDH 활성도에 대한 작용과 전혀 상반되는 결과로 나타난데 대한 기전은 알 수 없으나 MAO apoenzyme과 Rb 및 이들 동족체와의 공유 결합은 isoalloxazine 환의 8-α methyl 기와 이루어지며 SDH apoenzyme과의 결합은 isoalloxazine 환의 7-α methyl 기와 이루어지므로써 정상 MAO 및 SDH holoenzyme의 구조와 가까운 구조를 형성하는 양상에 따라 그 효소 활성도 다르게 표현되는 것으로 사료된다.