Thioredoxin이 신경 세포의 산화적 손상에 미치는 영향

Abstract

Thioredoxin은 자체의 환원력을 이용하여 산화물을 직접 제거하는 항산화 작용을 하거나 산화적 손상을 받은 단백질을 재생할 뿐만 아니라, 산화-환원 반응을 통해 NF-kB(nuclear factor kappa B)나 AP-1(activator protein - 1)등 전사 인자의 활성을 조절하고 interleukin, tumor necrosis factor와 같은 cytokine의 생산을 증가시키며 세포 증식 및 세포 고사(apoptosis)를 방지하는 등 여러 생물학적 현상을 유발함으로써 산화-환원 반응에 의한 생체의 신호전달체계에서 중심적인 역할을 하는 단백질이다. 한편, thioredoxin은 산화적 손상시 발현이 증가함으로써 산화적 스트레스 상태에서 생체 방어와 적응 반응에 필요한 단백질이라고 인식되고 있다. 본 연구에서는 신경 세포에 대한 hydrogen peroxide, diamide 및 6-hydroxydopamine 등에 의한 산화적 손상과 혈청 결핍에 의한 손상을 유발한 후 대장균 thioredoxin의 영향을 관찰함으로써, thioredoxin의 다양한 기전에 의한 신경 세포 손상에 대한 역할을 규명하고자 하였다. Rat의 pheochromocytoma 세포주인 PC 12 세포를 10% fetal calf serum이 함유된 RPMI 1640 media에서 배양하여 96 well plate에 각 well당 30,000개의 세포 농도로 계대배양한 후 사용하였다. Thioredoxin처치 30분 후에 hydrogen peroxide, diamide, 6-hydroxydopamine을 각각 처치하였으며 그 후 24시간동안 배양하였다. 세포 독성과 생존도의 평가는 lactate dehydrogenase(LDH) 유리와 3-[4,5-dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) 환원을 측정하였다. 연구 결과, PC 12 cell에 대한 hydrogen peroxide에 의한 산화적 손상에 대하여 thioredoxin은 LDH 유리를 감소시키고 MTT 환원의 감소를 방지하여 세포 독성을 감소시켰고 hydrogen peroxide와 동시에 처치한 thioredoxin도 hydrogen peroxide에 의한 세포 독성을 감소시켰다. Diamide에 의한 산화적 손상에 대하여 thioredoxin은 LDH 유리를 감소시켰으나 MTT 환원의 감소는 방지하지 못하였다. 한편, 6-hydroxydopamine 에 의한 산화적 손상과 혈청 결핍 조건에 대하여 thioredoxin은 세포 독성을 방지하지 못하였을 뿐만 아니라 오히려 증가시켰다. 결론적으로 신경 세포를 모델로 한 실험에서, 대장균의 thioredoxin은 hydrogen peroxide와 diamide와 같은 산화제를 직접적으로 제거하거나 억제함으로써 PC 12 세포를 보호하였으나, 세포 고사를 일으키는 6-hydroxydopamine과 혈청 결핍 조건과 같은 세포 내 기전에 의한 산화적 손상에 대하여는 세포 독성을 방지하지 못하였는데, 이는 혈청이 있는 조건에서는 thioredoxin의 독성이 관찰되지 않았으므로, thioredoxin 자체의 독성이라기 보다는 최근 세포 고사를 방지하는 것으로 알려진 nuclear factor(NF-kB)의 활성화를 저하시켜서 나타나는 결과로 생각된다. 따라서 thioredoxin의 항산화 방어 작용은 산화적 손상의 기전이 달라짐에 따라 효과가 다르게 나타남을 알 수 있었다. 향후 세포 내 기전에 의한 산화적 손상에 대한, 내인성 항산화 방어 인자로서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려진 thioredoxin의 작용 기전을 규명하고 NF-kB와의 연관성에 관한 연구가 계속 되어야 할 것이다. ; Thioredoxin is an endogenous antioxidant which scavenges directly reactive oxygen species(ROS) and regenerates oxidatively damaged protein by its reducing potential at the redox active disulfide(-Cys-Gly-Pro-Cys-) site. Thioredoxin regulates the activities of transcriptional factors such as NF-kB(nuclear factor kappa B) and AP-1(activator protein-1), increases the synthesis of cytokines and therefore prevents cellular proliferation or apoptosis. Under oxidative stress, thiredoxin plays out protective and adaptative roles by inducing its expressions. The aim of this study was to clarify the role of thioredoxin on neuronal cell injury by various mechanisms. We investigated the effects of E. coli thioredoxin, also acting as a substrate for mammalian thioredoxin reductase, on protecting against oxidative neuronal cell injury under various types of serum deprivation and of oxidative stresses such as hydrogen peroxide, diamide and 6-hydroxydopamine. PC 12 cells were cultured in RPMI 1640 media containing 10% fetal calf serum and subcultured in 96-well plates in that each well contained 30,000 cells. Cells were treated with hydrogen peroxide, diamide or 6-hydroxydopamine 30 minutes after thioredoxin treatment and then incubated for 24 hours. Cytotoxicity and cellular viability were assessed by measurement of lactate dehydrogenase (LDH) release and MTT reduction. As a result of this study, thioredoxin not only decreased the cytotoxicity of PC 12 cell treated with hydrogen peroxide by decreasing LDH release and preventing the decrease of MTT reduction but also thioredoxin showed greater protective effects when simultaneously treated with hydrogen peroxide. Also, thioredoxin decreased cytotoxicity by decreasing LDH release from PC 12 cells damaged by diamide. Thioredoxin did not prevent the decrease of MTT reduction on PC 12 cells damaged by diamide. On the other hands, thioredoxin increased cytotoxicity of PC cells induced by 6-hydroxydopamine and serum deprivation instead of protecting them. In conclusion, thioredoxin protected PC 12 cells under oxidative stresses by directly scavenging and inhibiting oxidants such as hydrogen peroxide and diamide but potentiate oxidative injury through intracellular mechanisms by 6-hydroxydopamine and serum deprivation. The cytotoxicity of thioredoxin may be mediated by decreasing the activity of NF-kB, which has been reported recently as protector against cellular apoptosis. It can be supported by the evidence in that the cytotoxic effect was not increased in condition of presence of serum of this study. Therefore, we found that the antioxidant effects of thioredoxin depended on mechanisms of injuries. In the future, the protective effects of thioredoxin on neuronal cell injury by intracellular mechanisms and its relation with NF-kB should be studied succeedingly.