Structural and functional characterization of human Nucleoside Diphosphate Kinase (Nm23)

Abstract

사람의 Nm23 단백질은 세포내에서Nm23-H1과 Nm23-H2이 다양한 비율로 혼합된 hexamer로 존재한다. 대부분의 Nm23단백질은 NDP kinase 효소 활성을 가지며, nucleoside triphosphate의 말단 인산기를 nucleoside diphosphate로 전달하는 반응을 촉매화한다. 본 연구에서는 서로 다른 oligomeric 구조를 가진, 사람의 적혈구 세포에서 분리한 cellular Nm23과 recombinant Nm23-H1, Nm23-H2을 순수분리하고, 단백질의 특징을 확인하였다. 또한 단백질의 structural domain을 찾기 위해 chimeric 단백질인 Nm23-H1N2C와 Nm23-H2N1C를 만들고, 이 단백질들의 생화학적 특성을 Nm23-H1, Nm23-H2 단백질의 특성과 비교, 분석하였다. 4개의 Nm23 단백질은 자가인산화, 효소 활성, DNA binding 하는 성질에 대해 분명히 구별되었다. 적혈구에서 분리한 Nm23 단백질 성질은, Nm23-H1과 Nm23-H2 단백질의 성질을 합쳐 놓기 보다는 자체의 고유한 특성을 가지고 있었다. 이와 같은 결과는 Nm23-H1의 결정화 연구와 더불어 Nm23 단백질의 구조가 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있으며, 나아가서 Nm23의 다양한 기능의 조절을 설명해 줄 수 있는 새로운 가능성을 제시하였다. Nm23 단백질은 전이 억제, 식물에서의 phytochrome 반응, proliferation과 differentiation의 조절, 세포사멸과 같은 여러 가지 세포 반응에 관여하고 있다. 이와 같이 다양한 기능을 가졌다는 사실은 Nm23이 신호전달에 관여할 수 있으리라는 가능성을 제시해 주었다. 본 연구에서는 Xenopus oocyte system과 mammalian cell system을 이용하여, Nm23 단백질이 세포 신호전달에 관여할 수 있는 새로운 기능이 있음을 증명하였다. Xenopus에서 Nm23 단백질의 과다발현은 progesterone에 의해 유도되는 maturation을 저해하는 것이 확인되었다. 이러한 저해 활성은 Nm23-H1과 Nm23-H2 단백질 모두가 가지고 있었으며, 효소 활성이 없는 mutant에서도 유사한 결과가 확인되었다. Nm23 단백질의 발현은 progesterone을 처리한 oocyte에서 Mos 단백질의 합성과 p42 MAPK의 활성화를 저해하였으나, Mos에 의한 p42 MAPK 활성화에는 영향이 없었다. 따라서 Nm23 단백질의 영향은 Mos/MEK/p42MAPK의 윗 단계에 작용하는 것으로 보인다. 이 연구는 세포 신호전달에서 Nm23의 새로운 기능을 제시하였다. Xenopus system과는 달리, 사람의 epithelial cell에서 Nm23 단백질을 과다발현시켰을 경우 cell growth나 특정 단백질의 발현에 영향이 없었다. 최근, 공동연구자인 배재대학교 김은희 교수님 연구팀에서 사람 Nm23의 N 말단을 이용하여 yeast two-hybrid assay를 시행한 결과, Nm23 단백질이 Fas associate factor1 (hFAF1)과 결합되어 있음이 밝혀졌다. 이에 mammalian cell에서 Nm23 단백질이 hFAF1과 더불어, 세포 사멸 신호인 Fas 신호 전달에 관여되어 있는지를 확인하고자 하였다. Nm23 단백질과 hFAF1의 결합은 mammalian cell에서도 확인 되었으며 이 결합은 Fas 신호에 반응하였다. Nm23-H1과 hFAF1 단백질이 함께 발현된 HeLa cell은 hFAF1만 발현된 cell에 비해 Fas 신호전달에 민감하게 반응하여 세포사멸을 도와주었다. Fas 신호가 활성화되는 동안 hFAF1은 새로운 단백질간의 결합에 관여하고 있었으며, 이 단백질은 immunoprecipitation과 MALDI-TOF mass 분석법에 의해 clathrin임이 밝혀졌다. 이 연구는 Nm23 단백질이 신호전달체계에서 어떻게 작용할 수 있는지를 분자적 수준에서 제시하고자 하였다. ; Human cellular Nm23 proteins mainly exist as homo- or hetero-hexamers of two 152 amino acid isoforms, the acidic Nm23-H1 protein and the basic Nm23-H2 protein. Nm23 proteins possess NDP kinase activity, catalyzing the transfer of the terminal phosphate of nucleoside triphosphates (NTPs) to nucleoside diphosphates (NDPs). We characterized the biochemical properties of various Nm23s, cellular Nm23 from human erythrocytes, recombinant Nm23-H1 and Nm23-H2. To find structural domain illustrating Nm23 s several functions, chimeric proteins (Nm23-H1N2C and Nm23-H2N1C) were constructed and their contribution to Nm23 s biochemical characteristics were examined. Four recombinant Nm23 proteins were clearly discriminated in biochemical properties including autophosphorylation, enzymatic stability and DNA binding activity. Cellular Nm23 from erythrocytes was shown to have the unique characteristics rather than the expected additive properties of Nm23-H1 and Nm23-H2. These findings suggest the possibility that the quaternary structures of Nm23s could affect their biochemical characteristics and might be related to the regulation of their cellular functions. Nm23 has been implicated in a wide variety of biological processes, including suppression of metastasis, phytochrome responses in plants, regulation of proliferation and differentiation, and apoptosis. These several biological effects of Nm23 have been raised the possibility that Nm23 may be involved in the regulation of signal responsiveness. We demonstrated that Nm23 has the potential to be a regulator in two signaling pathways, progesterone-induced maturation in Xenopus and Fas-mediated cell death in mammalian cells. In Xenopus oocyte system, modest overexpression of Nm23 was found to inhibit progesterone-induced maturation. This maturation-inhibitory activity was shared by both Nm23-H1 and Nm23-H2, and by Nm23 mutants that lack NDP kinase activity. Expression of Nm23 proteins delayed the accumulation of Mos and activation of p42 MAP kinase in progesterone-treated oocytes, but had no discernible effect on Mos-induced p42 MAP kinase activation. Therefore Nm23 appears to act upstream of the Mos/MEK/p42 MAP kinase cascade. These findings suggested a novel biological role for human Nm23 in signal transduction. In human epithelial kidney cells, only overexpression of Nm23 proteins neither exerted significant effects on cell growth nor was related to the regulation of protein expression. Instead, we found that Nm23 protein was functionally correlated with hFAF1 in Fas-mediated signaling pathway. Using C-terminus of human Nm23 as a bait in yeast two hybrid assays, E. Kim group (Paichai Univ., Korea) found that Nm23 was associated with human Fas-associated factor 1 (hFAF1), which was consistent in mammalian cells. Because FAF1 was originally identified as a Fas-associated protein, we examined whether human Nm23 and FAF1 are involved in Fas-induced apoptotic cell death. Co-expression of Nm23-H1 and hFAF1 in HeLa cells was found to increase the susceptibility to Fas stimulus. During Fas-mediated cell signaling, the subcellular distribution of Nm23 and hFAF1 was investigated and hFAF1-interacting molecule was identified using immunoprecipitation experiment and MALDI-TOF mass analysis. These findings suggested a novel biological potential of Nm23 illustrating how Nm23 could work in signaling pathway.