Immunogenicity of antigens encapsulated in pH-sensitive liposomes : induction of both cellular and Humoral Immune Responses Implicated Potential Clinical Applications

Abstract

세포독성T임파구는 중요한 방어 기작의 하나로 특히, 바이러스 질환과 암에 특효하다. 바이러스가 생산하는 단백질이나 일반 세포가 암 세포화 되면서 생긴 단백질은 세포독성T임파구의 주요한 표적이다. 세포독성T임파구를 유도하기 위해서는 항원이 세포질로 이동하여 제 1 형 주조직 적합분자의 제한적인 항원제시 과정을 거쳐 항원이 세포 표면에 제시되어야 한다. 펩타이드 항원은 부작용 없이 펩타이드 특이적 T임파구를 요도할 수 있다. 그러나 펩타이드는 면역원성이 낮기 때문에 효과적인 T임파구를 유도하기 위해서는 적절한 면역 보조제 및 항원 절달 방법이 필요하다. 본 연구에서, 하나의 수용성 부분과 하나의 이중 지질막으로 구성된 소입자인 리포좀을 면역 보조제로 사용하여 쥐를 모델로 하여 T 세포독성임파구를 유도하였다. pH-민감 리포좀은 약물전달체로써, 항원을 세포질 내로 운반한다고 잘 알려져 있으며, 쥐에서 항원을 함유한 pH-민감 리포좀은 세포독성T임파구를 유도하였다. Influenza NP나 Sendai NP의 세포독성T임파구의 epitope peptid를 pH-민감 리포좀의 면역 보조제로써의 기능을 확인하는데 사용하였으며, 가장 효과적으로 세포독성T임파구를 유도하기위한 여러가지 조건을 잡는데도 사용하였다. 본 연구에 사용한 POPE/CHOHS로 만든 리포좀은 세포독성T임파구를 유도한다고 보고되어있는 DOPE/CHOHS로 구성된 리포좀과 마찬가지로 세포독성T임파구를 유도하였다. MPL에 의하여 세포독성T임파구의 반응성은 증가하였지만, 비특이적인 반응도 증가하였다. 본 연구에서, Influenza NP나 Sndai NP의 세포독성T임파구의 epitope peptid를 함유한 pH-민감 리포좀은 MPL없이도 T임파구를 유도하였다. 다양한 종류의 peptide를 대상으로 효과적인 T임파구를 유도하기 위한 pH-민감 리포좀의 조건으로 POPE/CHOHS/MPL의 비를 7:3:0.1로 결정하였으며, peptide/lipid의 비는 10으로 결정하였다. 이 pH-민감 리포좀은 4℃에서는 300일 동안 약 8%가 깨졌으며, 넣어준 peptide의 35-40%를 함유하였고, 1100±400 정도의 크기분포를 가졌다. 또한 Sendai NP peptide를 함유한 리포좀으로 면역한 쥐는 10달 동안 반응성이 있는 세포독성T임파구를 유지하고 있었다. 이 pH-민감 리포좀은 HIV-1의 IIIB, MN, RF, SF-2에서 유래한 gag V3 loop peptide를 포함하였거나 245 개의 다른 종에서 선정한 consensus 서열을 포함한 chimeric particle로 제조한 VLP 함유하였을 때, 이것을 면역한 쥐에서 분리한 세포독성T임파구는 상호 반응성이 있었다. 이러한 상호 반응성은 각 peptide를 함유한 리포좀을 면역하여 확인하였는데, IIIB에서 유래한 peptide를 제외하고는 모두 상호 반응성이 있었다. 이러한 상호 반응성은 기존의 실험에 사용한 면역 보조제 보다 좋은 결과를 보여 주었다. 또한 subunit백신의 가능성을 알아보기 위하여, Influenza NP, LCMV NP, HIV-1 IIIB peptide를 연결고리없이 연결하여 peptide를 합성 후, 이를 함유한 리포좀으로 쥐를 면역하여, 각각의 epitope peptide에 대하여 세포독성T임파구의 기능을 조사하였다. 그 결과 각각의 epitope peptide 특이적인 반응을 볼 수 있었다. 이것은 연결된 peptide가 체내에서 원하는 epitope조각으로 잘려서 세포표면에 제시된다는 것을 증명하는 결과이다. 위의 VLP나 HIV IIIB peptide(R15K, T26K)를 함유한 리포좀을 면역하였을 때, 항체도 형성되어, T26K를 함유한 리포좀의 경우 ELISA 역가가 3000에서 6000 정도로 측정 되었으며, gp120단백이 western blot을 이용한 면역 분석법에서 검출되었다. 이상의 결과는 새로운 pH-민감 리포좀인 POPE-pH 민감 리포좀이 B 세포 및 T 세포 epitope를 함유한 peptide를 포획했을 때, 항원 항체 반응과 세포 독성 반응 모두를 유도할 수 있다는 것을 보여 주었다. B16 melanoma는 잘 알려진 종양 모델 세포이다. pH-민감 리포좀을 이용한 종양 치료도 시도하였는데, 모델 항원으로 Hantaan NP와 사람 Papilloma virus NP를 사용하였다. 표적 종양 세포를 만들기 위하여 Hantaan NP와 사람 Papilloma virus NP를 각각 B16 melanoma 세포에 형질도입하였으며, 각각에 대하여 epitope peptide를 선정하여 pH-민감 리포좀을 제조하였다. 이 리포좀을 쥐에 면역하였을 때, 각각의 peptide 특이한 세포독성T임파구가 생성되었으며, Hantaan NP peptide를 함유한 리포좀을 면역한 쥐는 Hantaan NP를 형질도입 시킨 B16 melanoma세포의 종양형성을 억제하였으며, 종양세포를 먼저 접종하고 리포좀을 접종한 경우 종양의 성장을 지연시켰다. 종양 성장을 억제하는 40일 동안 생성된 세포독성T임파구의 반응성은 유지되었으며, IL-2와 IFN-γ같은 Th1형질의 림포카인이 분비되었다. 이러한 결과는 pH-민감 리포좀이 세포독성T임파구를 매개로하는 종양 치료법에서 효과적인 peptide 전달체라는 것을 보여주었다. 본 연구에서는 peptide 항원을 대상으로 세포독성T임파구의 반응성을 가장 효율적으로 수행할 수 있는 pH-민감 리포좀의 조성 및 조건을 결정하였고, 이를 확인하기 위하여 HIV-1 V3 loop peptide를 포획한 pH-민감 리포좀을 제조하고, 쥐에 면역하여, 항원 특이적 리포좀이 세포독성T임파구와 항체의 생성을 알아보았다. 본 연구에 사용된 있는 pH-민감 리포좀은 주요성분으로 POPE를 사용하였으며, 이는 DOPE를 주성분으로 한 기존의 리포좀에 비하여 더 좋은 면역 반응을 유도할 수 있었다. gag V3 VLP외에 peptide 항원에 대해서도 항체를 생산할 수 있었으며, HIV-1 치료에 적절한 상호 반응성도 더 뛰어난 수준으로 유도할 수 있었다. B16 melanom을 표적으로 하는 세포독성T임파구는 동물 실험에서 매우 효과적으로 작용하여 B16 melanom를 주사하기 이전에 유도된 것은 암의 형성을 방지하였고, B16 melanom 주사 이후에 유도된 것은 암의 성장을 지연시켰다. 이러한 결과는 리포좀과 항원 epitope를 이용한 항암효과의 유도에 있어서 매우 성공적인 결과라 할 수 있으며, 또 이러한 항암 면역 반응의 형성은 Th1형 사이토카인이 주요한 역할을 한다는 것을 보여주었다. 본 연구의 이러한 결과들은 리포좀을 이용한 면역 반응의 유도가, 특히 peptide를 항원으로 사용할 경우 임상적으로 응용될 수 있음을 제시하였다. ; The Cytotoxic T lymphocytes (CTL) is one of the major host defense mechanisms, especially against viral infection or in tumor rejection. The viral proteins or tumor-associated antigens are the major targets for the CTL. To induce CTL responses, the antigens must be delivered into the cytosol, processed and presented via major histocompatibility complex (MHC) class I restricted pathways. The peptide antigen can induce epitope peptide specific CTL responses without side reaction. Because of their low immunogenicity, however, adequate use of adjuvant and antigen delivery system are important to induce effective CTL responses. In this study, the liposomes, microscopic particles consisting of one lipid bilayer enclosing a single aqueous compartment were used as an adjuvant to induce CTL responses in a mouse model. The pH-sensitive liposomes as vehicles are well known for their capacity to deliver the antigen into the cytosol, and the CTL responses induced by epitope peptide encapsulated in pH-sensitive liposomes in mice have been described. The pH-sensitive liposomes composed of POPE/CHOHS could induce CTL responses likely by those of DOPE/CHOHS, which was reported to be composition for the induction of CTL response. Although the monophosphoryl lipid A (MPL) could enhance the CTL responses, it also enhanced the nonspecific CTL responses. In this study, InfV NP or Sendal NP CTL epitope peptides encapsulated in pH-sensitive liposomes (pH-somes) without MPL could also induce CTL responses. To induce effective CTL responses against various peptides with pH-somes, the composition of pH-somes was established as POPE/CHOHS/MPL(7:3:0.1), and the peptide/lipid ratio was set to 10. This pH-somes were leaked by about 8% at 4℃ for 300 days, had 35-40% of peptide encapsulation efficiency, and was distributed as 1100±400 nm particles. The mice immunized with SEndai NP peptide encapsulated in pH-somes maintained CTL responses for 10 months. The pH-somes were effective to induce cross-reactive CTL responses against HIV-1 gag-V3 domain chimeric particles that contained V3 from IIIB, MN, RF, and SF2 or consensus sequences from 245 different HIV-1 isolates. This cross-reactivity was confirmed with peptide encapsulated in pH-somes. Except for V3 peptide from IIIB, the others had cross reactivity. The effector cells from Balb/c mice immunized with these V3 peptides in liposome lysed p815 cells loaded with each peptide. To further study the effect of subunit on specific CTL induction with pH-somes, Influenza NP, LCMV NP and HIV-1 V3 IIIB peptides were aligned without linker. When the mice were immunized with this, specific CTL responses to each peptide were induced. The humoral immune responses were also induced with V3 peptide or chimeric particle encapsulated in pH-somes. As like HIV-1 V3 virus like particles, HIV-1 V3 IIIB 26mer peptide encapsulated in pH-somes could induce humoral immune responses in Balb/c mice. Titer of 3000-6000 was shown in ELISA, and gp120 was detected in WEstern blot. B16 melanoma has been a well-known mouse tumor model. The pH-somes were tried for tumor therapy. HTN NP or HPV E7 transfected B16 melanoma were prepared as target tumors. The epitope peptides encapsulated in pH-somes were prepared to induce effective CTL responses for tumor therapy. There have been many studies for tumor therapy mediated by cytotoxic T lymphocytes (CTL) that recognize tumor-associated antigens. In this work, immunization of mice with CTL epitope peptides from Hantaan nucleocapsid protein (M6) or human papilloma virus E7 protein (P14) encapsulated in pH-somes induced effective antigen-specific CTL responses. The CTL responses induced by M6 peptide encapsulated in pH-somes blocked the formation of tumor mass from HAntaan NP transfected B16 melanoma cells in C57BL/6 mice and delayed the growth of pre-inoculated mealnoma cells. During the blockade of the tumor growth, the CTL response was maintained for at least approximately 6 weeks, and the mice secreted Th1 type cytokines such as IL-2 and IFN-γ. These results suggested that the pH-sensitive liposomes might provide an effective peptide delivery system for CTL-mediated tumor therapy. In this study, the pH-somes composed of POPE were characterized to induce most effective CTL responses against peptide antigen. Immunization of the mice with HIV-1 V3 loop peptide encapsulated pH-somes induced both CTL and humoral immune responses, and cross-reactive CTL responses against other peptides. The mice immunized with HTN M6 encapsulated in pH-some also induced effective CTL responses to reject the formation or delayed the growth of B16 melanomas that transfected with HTN NP. These CTL responses were Th1 and CD8+ T cell mediated. The POPE pH-somes were shown to be good peptide antigen delivery system in that with only peptide, they induced the effective CTL responses in vivo.