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알코올 탈수소효소 구조와 활성의 상관성에 관한 연구

Title
알코올 탈수소효소 구조와 활성의 상관성에 관한 연구
Authors
류지원
Issue Date
1997
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Abstract
알코올 탈수소효소 단백질을 구성하는 특정 아미노산 잔기와 효소의 활성과의 상관관계를 규명하고자 효모와 말의 간에서 유래한 알코올 탈수소효소의 유전자와 cDNA를 이용하여 효소의 조효소 부착부위(224번과 269번 위치)와 효소반응의 수소전달계 관련부위(51번)의 아미노산 잔기들을 위치 특이적 변이방법을 통하여 변이시킨 후 효소를 각각 적당한 숙주세포에서 발현시키고, 효소 단백질을 분리정제하여 변이효소의 특성을 야생형 효소와 비교하였다. Yeast alcohol dehydrogenase (YADH)의 조효소 결합부위의 아미노산 잔기를 horse liver alcohol dehydrogenase (HLADH)와 비교할 때 조효소 부착부위의 adenine ribose 주위에 Asp-223, Lys-228, Phe-198은 YADH에서도 동일하지만 224번 아미노산 잔기는 HLADH에서는 Ile이며 YADH에서는 Gly으로 서로 상이하다. 이러한 아미노산 잔기의 차이가 두효소의 활성에 있어서의 차이를 설명할 수 있는지를 확인하고자 YADH의 224번 glycine 잔기를 isoleucine으로 치환한 변이효소를 얻어 실험하였다. 그 결과 G224I 변이효소는 NAD, 에탄올, NADH에 대한 Michaelis constant는 야생형 효소에 비하여 각각 5.5, 3, 3배가 증가되었고, 아세트알데하이드에 대한 Michaelis constant는 변화가 없었다. 정반응과 역반응의 turnover number는 각각 9, 4배 정도로 감소되었다. 반응 생성물에 의한 저해실험결과로부터 반응기전이 Iso-Theorell Chance로 변화되었음을 확인하였다. HLADH와 비교할 때 조효소에 대한 낮은 친화성을 나타내는 YADH의 성질은 조효소 부착부위의 아미노산 잔기중 하나인 Gly-224만에 의한 것은 아니며 기타 다른 아미노산 잔기와 그로인한 3차구조의 차이에 기인할 것으로 추정되었다. HLADH-S의 조효소의 결합부위에 존재하는 Ile-269을 Ser으로, Ile-269와 Ile-224를 모두 Ser으로 치환한 두가지 변이효소에 대하여 반응속도론적 연구와 생촉매로서의 응용성을 시험한 결과는 다음과 같았다. I269S와 I269S/I224S 효소는 야생형 효소에 비하여 비활성이 49배, 6배 증가되었다. 두변이효소의 Km값은 전반적으로 모두 증가하였다. NAD, 에탄올, 아세트알데하이드, NADH에 대하여 각각 I269S 효소가 67, 63, 20, 11배, I269S/I224S 변이효소의 경우 157, 248, 12, 77배가 증가되었다. 정반응과 역반응에 대한 turnover number는 I269S와 I269S/I224S 각 변이효소에서 15배, 4배와 5.2배, 1.5배 증가하였다. 반응 생성물과 기질 유사체에 의한 저해연구에 의하여 두 변이효소의 반응기전은 Ordered Bi Bi로서 야생형 효소와 동일하였고, 기질 유사체인 TFE과 HFB에 대하여 I269S는 26배와 34배, I269S/I224S의 경우는 79배, 167배 친화성이 감소되었다. I269S 변이효소는 9가지 일급 알코올에 대하여 turnover number가 6∼28배까지 모두 증가하였다. 그러나 탄소수 5개미만, 10개 이상인 경우에는 크게 증가된 Km값으로 인하여 촉매효율(Vmax/Km)이 10배까지 감소하였고, 탄소수가 5∼9개인 경우는 유사한 촉매효율(Vmax/Km)을 나타내었다. I269S/I224S 변이효소는 9가지 일급 알코올에 대한 turnover number는 2∼13배까지 증가하였고 Km값은 9∼102배까지 증가되었다. 결과적으로 촉매효율(Vmax/Km)은 모든 일급 알코올의 경우에 있어서 야생형 효소의 1.4∼23.2배 감소하여서 I269S 변이효소 경우와 차이를 보였다. I269S 변이효소는 5 -cholanic acid-3-one과 5 -androstane-3,17-dione에 대하여 turnover number가 2배 증가하였고, 5 -androstane-3,17-dione에 대한 촉매효율(Vmax/Km)은 3.5배 증가하였다. I269S/I224S 변이효소의 경우는 5 -cholanic acid-3-one에 대하여 활성을 나타내지 않았으며, 5 -andro- stane-3,17-dione에 대하여 Km값과 turnover number가 야생형 효소와 유사하였다. I269S 변이효소는 all-trans-retinol과 all-trans-retinal에 대한 turnover number가 각각 40, 20배 증가하였고, retinal에 대한 촉매효율(Vmax/Km)은 약 10배가 증가되었으나 I269S/I224S 변이효소는 레티노이드를 전환할 수 있는 능력을 상실하였다. I269S 변이효소는 5 -cholanic acid-3-one을 분리정제된 효소, 세포파쇄액 및 whole cell을 이용한 모든 경우에서 lithocholic acid로 전환시켰고, whole cell의 경우 50%정도 전환능이 향상되었다. Alginate에 의한 고정화로 lithocholic acid의 생성량이 36%정도 증가 되었다. 이상의 실험 결과는 269번과 224번 위치의 Ile은 X선 회절 자료에 의한 3차구조에서 제시된 바와 같이 조효소의 친화성에 크게 영향을 주는 아미노산 잔기임을 증명해 준다. 한편 기질 유사체에 의한 저해연구의 결과와 스테로이드 및 레티노이드 기질에 대한 효소 활성의 변화에서 볼 수 있듯이 조효소 부착부위의 아미노산 잔기의 변이가 기질의 친화성에 관련되는 기질 부착부위의 3차구조에도 영향을 야기함을 추정하게 한다. HLADH-E 유전자의 His-51에 해당하는 코돈을 Ser 또는 Tyr으로 치환시켜 얻은 효소에 대해 효소 반응속도론적 연구와 화학적 수식 실험을 실시한 결과는 다음과 같았다. 효소의 비활성은 야생형 효소가 2.98 U/mg을 나타낸 반면 H51Y는 4.21 U/mg, H51S는 0.72 U/mg였다. H51S와 H51Y 변이효소의 Km 값은 NAD+, 에탄올, 아세트알데하이드, NADH에 대해 야생형 효소와 비교하면 각각 6, 1.5, 2.4, 3배와 47, 11, 6, 12배가 증가되었고, turnover number는 정반응의 경우 야생형 효소에 비해 각각 0.3, 6.6배였고 역반응의 경우 0.7배, 9배로 나타났다. H51S는 정반응 및 역반응의 촉매효율(Vmax/Km)이 각각 5, 3배 감소되었으나 H51Y의 경우는 야생형 효소와 큰 차이를 보이지 않았다. 생성물과 기질 유사체에 의한 저해실험 결과, 효소의 반응기전은 야생형 효소와 동일한 Ordered Bi Bi 기전을 따를 것으로 생각되었으며, trifluoroethanol와 heptafluorobutanol에 의한 저해상수가 각각 H51S는 36, 35 μM이었고 H51Y는 79, 31 μM로 H51S는 4∼7배, H51Y는 6∼9배 기질에 대한 결합능력이 감소되었음을 알 수 있었다. 에탄올을 기질로 사용한 경우 Kcat의 pH 의존성을 살펴보면, 야생형 효소 경우 pKa값이 7.5와 9.2의 두개를 지니는 반면, H51S는 9.1정도의 한 개 값만을 가지는 것으로 나타났으며, H51Y의 경우 거의 직선상의 형태를 나타내는 것을 볼 수 있었다. 7.5의 pKa값은 His-51 잔기에 의하여 나타나는 것으로 His-51 잔기가 효소의 Kcat의 pH 의존성을 결정하는 중요한 잔기임을 확인할 수 있었다. Turnover number의 pH 의존성은 야생형 효소가 7.2의 pKa값을 보이는 반면 H51S와 H51Y 변이효소는 각각 7.9와 8.2의 값을 나타내었고, 야생형 효소가 0.5 log unit 범위내에서 변화되는 반면 변이효소의 경우 1.5 log unit내에서 변화하여 보다 pH 의존성이 큰 것을 확인할 수 있었다. TFE 결합의 pH 의존성을 실험한 결과, 야생형 효소가 7.8의 pKa값을 갖는 반면, H51S는 9.0으로 나타났고 H51Y는 pH 6∼10범위에서 거의 일직선으로 나타났다. 이러한 pKa값에 있어서의 이동은 아연에 결합한 물의 상태가 51번 아미노산 잔기의 측쇄에 의한 영향을 받아 변화되는 것에 기인할 수 있다. 이렇게 pKa값이 야생형 효소에서 더 낮은 이유는 His-51 잔기상에 존재하는 양전하에 기인하는 것으로 생각된다. DEPC 수식의 pH 의존성을 실험한 결과, 야생형 효소가 pH 5∼10.25의 범위에서 유리형의 경우 6.8와 8.2를, ternary complex의 경우 5.8와 8.2의 각각 2개의 pKa값을 지니는 반면, H51S 변이효소는 7.8(유리형 효소)와 7.8(ternary complex), H51Y 변이효소는 7.8(유리형 효소)와 8.0(ternary complex)으로 각각 1개씩의 pKa값만을 지니는 것으로 나타났다. 이로부터 His-51잔기에 의하여 나타나는 pKa값은 6.8(유리형 효소) 또는 5.8(ternary complex)인 것으로 보이며, 8.2(유리형 효소) 또는 8.2 (ternary complex)의 값은 효소 활성에 관여하는 다른 histidine잔기인 67번 잔기에 의한 것으로 생각되었다. 효소 활성의 안정성 실험의 결과 야생형 효소가 일차의 활성 감소 경향을 보이고 그 반감기가 30일인 반면, 변이효소는 초기 2주(H51S)내지는 3주(H51Y)간은 효소 활성이 100% 유지되다가 그 이후에 일차의 활성 감소 경향을 보이며 반감기는 각각 26일(H51S)과 38일(H51Y) 이었다. 이로부터 변이효소의 초기 안정성이 증가됨을 확인할 수 있었다. ; In this study, we compared wild-type alcohol dehydrogenase (yeast and horse liver) and its corresponding mutant enzyme to examine the relationship between structure and enzymatic function. Mutation of active site amino acid was conducted by site-directed mutagenesis on YADHⅠ or HLADH genes and each mutant enzyme was expressed. To identify the characteristics of the mutant enzyme, we carried out various kinetics experiments (initial velocity measurement, product and dead-end inhibition studies, substrate specificity, pH dependency and chemical modification studies) and compared these results with wild-type s. Gly-224 residue of YADH was mutated by Kunkel site-directed mutagenesis method to isoleucine, which is the corresponding amino acid residue of HLADH. The mutated gene on M13 vector was subcloned in YEp13 and used to transform Saccharomyces cerevisiae 302-21#2 strain and the expressed protein was purified. The turnover numbers of mutant enzyme for ethanol and acetaldehyde were decreased 9 and 4-fold, respectively compared to wild-type enzyme. The results of product inhibition studies indicated that the reaction mechanism was changed to Iso Theorell-Chance from Ordered Bi Bi. Therefore, we could suppose that the substitution resulted in destabilizing enzyme- coenzyme-substrate complex and changing the enzyme reaction mechanism. Ile-269 in HLADH isoenzyme S was mutated to serine by phosphoro- thioate-based site-directed mutagenesis method in order to study the role of the residue in coenzyme binding. The specific activity of the mutant (I269S) enzyme to ethanol was increased 49-fold. The Michaelis-Menten constant for NAD, ethanol, acetaldehyde and NADH were increased 67, 63, 20 and 11-fold and turnover numbers for forward and reverse reaction were also increased 15 and 4-fold. All turnover numbers of I269S enzyme toward 9 primary alcohols were increased 6∼28-fold than wild-type. The mutant enzyme showed 3.5, 4.6, 11.6-fold higher catalytic efficiency for 5 -androstane-3,17-dion, 5 -cholanic acid-3-one and retinal than wild-type, respectively. The reaction mechanism of I269S enzyme was ordered Bi Bi as wild-type s. These results indicate that the hydrophobic interaction of Ile-269 residue with coenzyme plays an important role in dissociation of coenzyme from enzyme-coenzyme complex, which has been known as the rate limiting step of ADH reaction. Ile-224 in I269S mutant horse liver alcohol dehydrogenase isoenzyme S (HLADH-S) was mutated to serine by unique site elimination site-directed mutagenesis method in order to study the role of the residue in coenzyme binding to the enzyme. The specific activity of the I269S/I224S mutant enzyme to ethanol was increased 6-fold and all Michaelis constants (Ka, Kb, Kp and Kq) were larger than those for the wild-type and I269S enzyme. The substitution decreased the affinity to coenzymes and increased the specific activity of the enzyme. The mutant enzyme showed the highest catalytic efficiency for octanol among the primary alcohols. But it didn t show activities on retinoids and 5 -cholanic acid-3-one. From these results, it was confirmed that the hydrophobic interaction of Ile-224 residue with coenzyme was related to coenzyme affinity in ADH reaction. The substitution of amino acid residue in coenzyme binding site at 269 and 224 could also affect to the tertiary structure of substrate binding site. That is, there might be communication between coenzyme and substrate binding domain. His-51 in HLADH isoenzyme E was mutated to serine by unique site elimination site-directed mutagenesis method in order to study the role of the residue in proton-relay system and catalysis of enzyme. The specific activity of H51S mutant enzyme to ethanol was decreased 4-fold and Ka, Kb, Kp and Kq were increased 6, 1.5, 2.4 and 3-fold, respectively. The catalytic efficiency were decreased 5-fold (forward reaction) and 4-fold (reverse reaction), respectively but the reaction mechanism of the enzyme was same as wild-type. pKa value for catalytic efficiency was 9.1 when ethanol was used as substrate and for dissociation constant of TFE was 9.0. pKa values for inactivation ratio (%) during modification of histidine residue of the wild-type and mutant H51S enzyme with DEPC was compared. While wild-type enzyme showed 6.8 and 8.2 (free enzyme) and 5.8 and 8.2 (ternary complex), the pKa values for H51S were 7.8 (free enzyme) and 7.8 (ternary complex). Enzyme stability of H51S was lightly increased . His-51 in HLADH isoenzyme E was also mutated to tyrosine by the same method as for H51S mutant enzyme. The specific activity of H51Y mutant enzyme to ethanol was increased 1.5-fold and Ka, Kb, Kp and Kq were increased 47, 11, 6 and 12-fold, respectively. The catalytic efficiency was almost same as wild-type and the reaction mechanism of H51Y enzyme didn t change. pKa values of catalytic efficiency for ethanol as substrate and dissociation constant of TFE could not be founded over 5.5∼10.0 pH range. pKa value for inactivation ratio (%) during modification of histidine residue of the wild-type and mutant H51Y enzyme with DEPC was compared. H51Y had only one pKa value, 7.8 (free enzyme) or 8.0 (ternary complex). Enzyme stability of H51Y enzyme was increased, compared to wild-type. My results for pH dependency studies of H51S and H51Y mutant enzyme indicated that pKa 7.5 for Kcat of wild-type enzyme result from histidine-51 residue and the residue play an important role in ternary complex formation and proton-relay system. From our results of DEPC modification of H51S and H51Y mutant enzyme, we concluded that the pKa value corresponding histidine-51 residue was 6.8 (free enzyme) and 5.8 (ternary complex) and the second pKa value of the wild-type (8.2: free enzyme and 8.2: ternary complex) came from the other histidine residue such as His-67 in active site of ADH.
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