부신수질 일차배양세포에서의 카테콜아민 생합성효소 유전자 발현의 콜린성 및 비콜린성 조절 기전

Abstract

The roll of the synpathoadrenal medullary system as the primary site of response to emotional and physiological stresses is well recognized, and regulation of catecholamine biosynthesis is crucial in the adaptation to various physiological conditions. Catecholamines, which include dopamine, norepinephrine, epinephrine are synthesized in vivo by the sequential reactions of the enzymes tyrosine hydroxylase(TH), aromatic L-amino acid decarboxylase(AADC), dopamine β-hydroxylase(DBH) and phenylethanolamine N-methyltransferase(PNMT). Of these TH, DBH and PNMT are specific for catecholamine effector thereby responding to cellular needs for catecholamines. Using primary cultured bovine adrenal medullary cells, the present study attempted to examine the effects of acethylcholine and the noncholinergic neuromodulators pituitary adenylate cyclase activating polypeptide(PACAP), Substace P, insulin like growth factor-I(IGF-I) and dexamethasone on gene expression and activities of TH, DBH and ,PNMT and the availability of catecholamines. The mRNA levels of the catecholamine synthesizing enzymes were elevated on treatment of chromaffin cells with carbachol(100uM) for 6hr to 48hr by 3-5(TH), 1.5-2(DBH) and 3-5(PNMT) folds. The total nor epinephrine and epinephrine amount were also increased to 135% and 116% of control, respectiely. The selective nicotinic and muscarinic antagonist (hexamethonium and atropine) each partially reduced the carbachol-stimulated increase in TH, DBH and PNMT mRNAs. Experiments using the selective cholinergic agonists muscarine(100uM) and nicotine(10uM) demonstrated that while both muscarinic and nicotinic receptor plays a predominant role which seems to be mediated by cAMP dependent protein kinase(PKA). PACAP(50nM) elevated the mRNA levels of TH, DBH and PMNT, when measured after a 24hr treatment by 3-7, 3-4 and 1.5 folds and caused increases in the specific activities of TH and DBH to 137% and 113% of control, respectively. The total norepinephrine level were increased to 227% of control, but epinephrine level were decreased to 88% and increased the release of norepinephrine and epinephrine by 6.9 and 8.3 folds. These effects of PACAP on TH, DBH, and PNMT were similar to the effects of forskolin and the PKA inhibitor H89 suppressed the PACAP effects indicating that PKA is involved. Treatment with substance P(10uM) did not significantly change the mRNA levels of activities of TH, DBH and PNMT or the total catecholamine contents. IGF-I(1nM) changed the level of the three enzyme gene transcripts within 24hr by 1.5-2, 4-6, and 1.5 folds and activities to 114%, 227% and 97% of control, respectively. And the release of norepinephrine and epinephrine were increased to 235% and 324% of control. The IGF-I treatment led to the activation of multiple signaling pathways such as PKA, protein kinase C(PKC) and calcium/calmodulin-dependent protein kinase(CaMKII). Dexamethasone(10uM), a stable analogue of glococorticoids, had no effects on DBH MRNA but increased TH mRNA by 1.6 folds and PNMK mRNA by 1.4 folds. The activities of these enzymes were not significantly changed after 48hr with 10uM. Dexamethasone caused an increase in the release of both norepinephrine and epinephrine in 48hr by 3-7 folds, while no significant change in the amounts of the stored catecholamines was observed. As the cells in vivo usually repond to combinations of specific extracellular signals the combined effects if cholinergic agonists and noncholinergic neuromodulators were examined. TH, DBH and PNMT mRNA levels were elevated to a larger degree in the cells trated with PACAP and muscarine/nicotine than PACAP or muscarine/nicotine alone, but in a non-additive fashion. Cotreatment with Substace P did not influence the nicotinic effects on TH, DBH and PNMT gene expression, but inhibited the nicotine-evoked release of catecholamines. IGF-I elevated the nicotinic effects on gene expression, specific activities and catecholamine synthesis. In the combined treatment with Dexamethasone and nicotine the level of DBH mRNA were reduced to control values. Taked together, the splanchnic nerve transmitter actylcholine not only evokes adrenal catechoamine secretion but also increases chromaffin cell increased the mRNA levels and specific activities of TH and DBH as well as the catecholamine contents indicating the important roles of these two neuromodulators in the regulation of catecholamine synthesis. On the other hand, Substace P did not affect the catecholamine synthesizing enzyme gene expression but modulated the nicotine-evoked release of catecholamines. Dexamethasone had no effect on basal DBH mRNA but inhibited nicotine-induced DBH gene expression. In conclusion, acetylcholice and these neuromodulators have important physiological role int the regulation of TH, DBH and PNMT gene expression and catecholamine synthesis by stimulating various intracellular signalling pathways in adrenal chromaffin cell, which would potentially provide regulation of finer turning toward the physiological needs for catecholamines. ; 다양한 외부로부터의 자극이나 생리적 변화에 적응하고 항상성(homeostasis)을 유지하는 것은 다세포생물의 생존에 매우 중요하다. 생체 내에서 이러한 기능을 주로 담당하고 있는 대표적 조절물질이 카테콜아민, 즉 dopamine, norepinephrine및 epinephrine이다. 카테콜아민은 생합성 특이효소인 tyrosine hydroxylase(TH), dopamine β-hydroxylase(DBH) 및 phenylethanolamine N-methyltransferase(PNMT)의 연속적인 작용에 의해 합성되며 이들 효소활성의 조절이 카테콜아민의 세포내 함량을 결정하는 중요한 요인이 되어 생체의 적응반응을 나타내게 된다. 본 논문에서는 소의 부신수질 1차 배양세포를 사용하여 아세틸콜린과 pituitary adenylate cylclase activating polypeptide(PACAP), Substance P(SP), insulin like growth factor-I(IGF-I) 및 glucocorticoid등의 비콜린성 조절물질들이 및 의 유전자발현과 활성도, 그리고 카테콜아민 함량에 미치는 영향과 작용기전을 규명하고자 하였다. 콜린 효능약인 carbachol(100uM)을 부신수질세포에 6시간에서 48시간까지 처리했을 때 TH, DBH, PNMT mRNA는 각각 3-5배, 1.5-2배, 3-5배로 증가하였다. 총 norepinephrine과 epinephrine생산량 또한 각각 대조군의 135%와 116%로 증가하였다. TH, DBH, PNMT mRNA에 대한 carbachol의 효과는 muscarine과 nicotine의 선택적 길항약인 atropine과 hexamethonium에 의해 각각 부분적으로 억제되었다. 콜린 효능약인 muscarine(100uM)과 nicotine(10uM)을 사용한 실험결과 카테콜아민 생합성효소의 유전자발현에 대한 carbachol의 효과에 nicotine과 muscarine수용체가 모두 관여하나 특히 nicotine수용체활성으로 인한 효과가 크게 나타났으며 이 때 세포내 cAMP dependent protein kinase(PKA)가 관여한다고 사료되었다. PACAP(50Nm) 24시간처리로 TH, DBH, PNMT mRNA가 3-7, 3-4, 1.5배 증가하였고 TH와 DBH의 활성도 역시 각각 137%, 113%로 증가하였다. 총 norepinephrine양은 227%로 증가하였으나 epinephrine은 88%로 감소하였으며 이때의 norepinephrine과 epinephrine의 유리량은 6.9 및 8.3배로 각각 증가하였다. TH, DBH 및 PNMT에 대한 PACAP의 효과는 forskolin의 효과와 비슷한 양상으로 나타났으며 또한 PKA억제제인 H89에 의해 그 효과가 억제되는 점 등으로 보아 PKA를 경유하여 나타나는 결과라고 사료되었다. Sulbstance P(10uM)는 TH, DBH 및 PNMT mRNA수준과 활성도, 총 카테콜아민양 모두에 영향을 미치지 않았다. IGF-I(1nM)은 24시간 처리에 의해 세 효소 모두의 유전자 발현을 각각, 1.5-2, 4-6 및 1.5배로 증가시켰으며 효소활성 역시 114%, 227%와 97%로 변화하였다. 총 카테콜아민양은 norepinephrine과 epinephrine이 127% 및 112%로 증가하였고 유리량도 235%, 324%로 증가하였다. 이러한 의 작용은 세포내에서 PKA, protein kinase(PKC) 및 calcium/calmodulin department protern kinase(CaMKII)와 같은 여러 가지 신호전달체계를 활성화함으로써 나타난다고 사료되었다. Glococorticoid의 합성화합물인 dexamethasone은 TH, PNMT mRNA를 각각 1.6배, 1.4배로 증가시켰으나 DBH mRNA에는 영향을 주지 않았다. 48시간 처리로 이들 효소의 활성 총 카테콜아민양이 변화하지않았으나 norepinephrine과 epinephrine의 유리는 3-7배로 증가하였다. 생체내에서 실제로 이러한 조절물질들의 효과가 외부의 자극에 대하여 복합적으로 나타나게 되므로 그 기전을 이해하고자 콜린 효능약과 비클린성 조절물질을 공동처리하여 그 효과를 관찰하였다. PACAP과 muscarine또는 nicotine의 공동처리로 TH, DBH 및 PNMT mRNA수준이 이들 약물 각각의 효과보다는 증가하였으나 그 정도가 두 약물의 효과를 합한 것보다는 작게 나타났다. Substace P의 공동처리는 TH, DBH, PNMT유전자발현에 대한 nicotine의 효과에는 영향을 주지 않았으나 Substace P 10uM처리로 nicotine에 의한 카테콜아민 유리를 억제함이 관찰되었다. IGF-I은 카테콜아민 생합성 효소의 유전자 발현과 활성도, 카테콜아민 생산등에 모두 그 효과를 증가시켰으며 dexamethasone은 nicotine에 의한 DBH mRNA증가를 억제하였다. 따라서 이들 신경전달물질 및 조절물질들이 부신수질에서 다양한 세포내 신호전달기전을 유도하여 TH, DBH 및 PNMT의 활성을 유전자수전에서 조절하며 그와 관련하여 카테콜아민의 세포내 저장량에도 영향을 미치는 것으로 사료되며 또한 이들이 상호간에 협동적, 길항적으로 작용하기도 하고 또는 독립적으로 그 효과를 나타냄으로써 생체 내에서의 카테콜아민 생합성계의 신경적응성(neural plasticity)을 유지하는데 기여한다고 사료된다.