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Influence of micro- and nano-topology on the differentiation of myoblast and human adipose tissue-derived stem cell

Title
Influence of micro- and nano-topology on the differentiation of myoblast and human adipose tissue-derived stem cell
Authors
Li, Yinhua
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 화학·나노과학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Master
Advisors
박성수
Abstract
미세 유체 그리고 마이크로나 나노 크기의 미세 지형구조와 같은 미세 제작된 세포배양 디바이스는 세포의 성질이나 줄기 세포 분화에 매우 훌륭한 도구로 응용되고 있다. 생체 내 세포는 여러 가지의 매크로 혹은 마이크로 크기의 환경에 접촉하게 된다. 하지만 전통적인 생체 외 세포 배양 방법은 이러한 환경을 모사하는데 한계를 가지고 있다. 이에 비해 미세제작 세포 배양 디바이스는 세포의 구조와 성질을 이해하는데 알맞은 삼차원적 환경을 제공해준다. 또한 생체내 미세환경을 모사할수 있는 디바이스가 체외에서도 쉽게 만들어질수 있기 때문에, 미세제작 세포 배양 디바이스는 줄기 세포 연구에 점점 중요한 역할을 하고 있다. 제 1장에서는 여러 가지 종류의 미세제작 세포 배양 디바이스와 그들의 생물학적 응용에 대해 정리하였다. 제 2장에서는 미세유체 칩과 나노지형 디바이스에 대해 설명하였다. 지방줄기세포는 성체줄기세포 중 가장 얻기 쉬운 줄기세포이고 임상적 응용 가능성과 다중 분화능 등의 특성을 가지고 있음이 보고되어 왔다. 미세유체 칩은 세포를 고농도로 칩 내에 가둠으로써 저산소 환경을 조성해주기 때문에 지방줄기 세포를 신경세포로 분화 유도 하는데 아주 유용한 시스템으로 이용되어 왔다. 또한 나노지형이 지방줄기세포를 신경세포로 분화 유도 한다는 연구가 알려져 있다. 하여 본 연구에서는 더욱 효율적으로 지방줄기세포를 신경세포로 분화하는 방법을 구축하고자 미세유체 칩과 나노지형 구조가 결합된 디바이스를 설계하였다. 본 디바이스는 세포를 미세유체 칩 내부의 가운데 위치하고 있는 미세 기둥 안에 가두고 14일간 신경분화배지가 아닌 일반 성장 배지를 공급하여 신경 세포로 분화하였다. 분화 유도 1일 후에 HIF-1a의 발현이 미세유체 칩이 없는 나노지형 구조물에서 분화한 세포에 비해 훨씬 증가하였음을 확인했다. 3일 동안 배양한 후 Oct4의 발현을 확인한 결과, 미세유체 칩이 없는 나노지형 구조물에서 분화한 세포에 비해 Oct4의 발현이 현저히 증가하였음을 확인했다. 7일간 배양 후 신경세포 마커인 Tuj1을 확인한 결과, 미세유체 칩과 나노지형 구조가 있는 디바이스에서 미세유체 칩이나 나노지형 구조에서보다 훨씬 많이 발현 되었다. 이런 결과로부터 미세유체의 저산소 환경이 지방 줄기세포를 분화능이 더욱 뛰어난 줄기세포로 역분화 시켜주고, 나노지형 구조물은 신경세포로의 분화를 촉진시켜주는 역할을 한다는 것을 보여준다. 제 3장에서는 미세제작 세포 배양 디바이스를 이용하여 C2C12 마이오블라스트 세포의 분화와 마이오튜브가 내는 힘의 측정에 대해 소개한다. 근육세포의 힘을 측정하는것은 근육질환을 연구함에 있어 가장 중요한 요소이다. 하지만 아직까지 마이오튜브를 형성하고 그의 힘을 측정할 수 있는 효율적이고도 적합한 디바이스가 보고 된 바가 없다. 본 연구에서는 마이오튜브의 형성과 그가 내는 힘을 측정하기 위해 두 가지의 디바이스를 소개한다. 첫번째는 미세유체 칩과 마이크로 홈 구조를 결합한 디바이스이다. 이 디바이스에서는 C2C12 마이오블라스트 세포를 마이크로 홈 구조 내에 정렬시킨다. 며칠간 배양을 하면 세포들이 서로 융합하여 핵이 여러개인 하나의 세포, 즉 마이오튜브를 형성하게 된다. 따라서 마이오튜브가 내는 힘을 마이크로 홈의 양쪽에 위치하고 있는 미세 탄성 기둥의 움직임으로 계산할 수 있다. 두번째 디바이스는 미세채널과 미세 탄성 기둥을 결합한 디바이스이다. 미세채널 세포 배양 시스템은, 미세 기둥은 미세채널의 양쪽에 위치하고 여러 개의 미세채널과 미세 기둥이 번갈아 가며 일렬로 나란하도록 설계되었다. C2C12 마이오블라스트 세포를 미세채널에 넣어 며칠간 배양을 하면 세포들이 서로 융합하여 다핵 마이오튜브를 형성하고 미세채널 양쪽에 위치하고 있는 미세 기둥에 붙는다. 따라서 미세기둥의 움직임을 계산함으로써 마이오튜브의 힘을 측정한다. 이 두가지 디바이스는 근육세포의 성질을 연구할 수 있는 좋은 시스템이 될 수 있을 것으로 기대된다. ;Microfabricated cell culture devices (μFCCDs) such as microfluidic and micro or nanotopographical surface could be used as effective tools to study cellular behaviors and stem cell differentiation. In vivo, cells suffering various macro- to microenvironments. Unfortunately, traditional cell culture system can’t mimic these environments in vitro. The major advantage of μFCCDs is that the dimension of μFCCDs is well suited to physical scale of cells. Therefore the mimic microenvironment can be easily fabricated in vitro. Because of this feature, μFCCDs is becoming increasingly important in stem cell researches. In chapter I, several μFCCDs and their biological applications were reviewed. In chapter II, integrated microfluidic chip and nanogroove device was demonstrated. Human adipose tissue-derived stem cells (hATSCs) have great potentials for cell therapy because of their multipotency and accessibility. Microfluidic chip is highly useful for neural differentiation of hASTCs by providing them with hypoxia as well as a high cell density condition. Previously, it was demonstrated that nanogrooves are able to direct neural differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). This study report that microfluidic chip with nanogrooves (500μm) can enhance the efficiency of neural differentiation of hATSCs due to combined effects of microfluidic cell culture condition and nanostructure. On this device, hATSCs was trapped by an array of micropillars in the middle of the microfluidic channel and cultured in neural growth medium without the use of neural induction medium for 14 days. hATSCs cells expressed more strongly hypoxia inducible factor 1a (HIF-1a) and the stemness marker Oct-4 at day 1 and day 3 in microfluidic chip with nanogrooves than those in either only microfluidic chip or nanogrooves without microfluidic chip. At day 5, the cells in microfluidic chip with nanogrooves started to present neuron-like morphologies and expressed early neuronal marker TuJ-1at day 7. These results suggest that neural differentiation of hATSCs directed by nanogrooves can be further enhanced by a microfluidic condition where cells experience hypoxia at a high cell density and thus mimic stem cell niche. In chapter III, μFCCDs for C2C12 myoblast cell differentiation and contractile force measurement are described. Contractile force of myotubes is one of key parameters for studying diseases related to muscles. However, there is lack of an efficient and affordable device for generating myotubes and quantifying the contractile force of each single myotube in vitro. In this study, we describe two cell culture device equipped with elastic posts for measuring contractile force generated by a single myotube in situ. First device is composed of microfluidic chip and microgrooves. On this device, C2C12 myoblast cells are aligned on microgrooves. After several days culture cells are fused together and generated contractile force. The force was calculated by measuring the displacement of micropillar which located on both side of the microgrooves. The second device is microchannel equipped with elastic posts. The microchannel cell culture system is composed of an array of microchannels and pillars located at both ends of each channel. When C2C12 myoblast cells were cultured in the microchannels for several days, they were fused to form multi-nucleated myotubes and then started to be attached to pillars in the channel. Since the contractile force of each myotube can be calculated from the bending degree of micropillars pulled by a single myotube, it is expected that our devices can be useful tool for studying the mechanical characteristics of myotubes in vitro.
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