방사선 조사후 백서공장점막세포의 재생과정에서 5-fluorouracil 투여가 phospholipase C와 ras 암유전자단백의 발현에 미치는 영향

Abstract

최근 외부자극에 대한 생체 신호전달체계에서 중요한 효소로 알려진 phospholipase C(PLC) 동위효소(isozyme)들의 발현은 조직의 종류와 발달과정에 따라 특이한 양상을 보이며 PLC동위효소 중 PLC-γ1은 세포의 성장, 분화 및 증식에 중추적 요소로 알려져 있다. 또한 ras 암유전자단백도 세포의 성장을 유도하는 것으로 알려져 있어 방사선 조사 후 PLC 동위효소와 ras암유전단백이 관여하는지를 규명하고, 이러한 재생과정에 방사선감작약물로 널리 알려져 있는 5-fluorouracil(5-FU)투여방법이 미치는 영향을 보고자 본 연구를 계획하였다. 흰쥐를 실험동물로 하여 정상대조군(I), 방사선조사 단독군(II), 방사선과 5-FU 12시간 지속성 정주병행군(III), 방사선조사 단독군 (II), 방사선과 5-FU12시간 지속성 정주단독군 (V), 5FU 일시정주단독군 (VI)로 나누어 관찰하였다. 방사선은 흰쥐 전신에 8Gy를 단일조사하고, 5-FU용량은 150mg/Kg을 투여하였다. 소장점막의 재생시간에 맞추어 흰쥐를 희생시키고 공장점막을 채취하여 phospholipase C 동위효소와 ras 암 유전자단백의 발현상을 보고자 면역조직화학 염색 및 Immunoblotting 을 시행하였고 hematoxylin과 eosin염색으로 조직병리학적 소견과 소낭선에서의 유사분열을 관찰하였다. 면역조직화학 염색 결과 PLC-γ1의 발현은 방사선과 5-FU 지속성 정주 병행군에 서 가장 강한 염색상을 보였고 그 다음으로 방사선 조사단독군, 방사선과 5-FU일시정주 병행군의 순이었고 5-FU 투여단독군들에서는 미약한 염색상을 보였고 정상대조군에서는 음성인 소견을 보였다. PLC-γ1의 발현을 공장점막의 부위별로 나누어 보았을 때 재생이 활발한 기저부위에서는 방사선과 5-FU 지속성 정주병행군에서 가장 강한 양성의 염색상을 보였고, 다음으로 방사선조사단독군, 방사선과 5-FU 일시정주병행군의 순이었으나, 점막의 손상으로 상피세포의 탈락을 보인 상층부위에서는 방사선과 5-FU 일시 정주 병행군에서 가장 강한 양성의 염색상을 보였다. ras암유전자단백의 발현은 PLC-γ1발현의 정도와 일치하는 소견을 보였다. 이러한 PLC-γ1 과 ras 암 유전자단백의 발현정도는 조직학적 소견에서 방사선과 5-FU 12 시간 지속성 정주병행군이 방사선 단독에 비해 정상 고장점막의 구조가 유지되는 소견을 보인 반면 5-FU일시 정주병행군은 방사선 단독에 비해 점막에 심한 손상을 보인 소견과 소낭선에서의 유사분열의 수와 일치하였다. PLC-β1의 발현은 방사선 및 5-FU 지속성 정주병행군과 방사선 및 5-FU 일시정주병행군에서만 강한 양성의 염색상을 보였고 그 외 모든 군에서 음성의 염색상을 보였다. PLC- δ1의 발현은 모든 실험군에서 음성의 염색상을 보였다. Immunoblotting 결과에서는 PLC- δ1과 PLC-β1의 발현은 면역조직 화학염색 결과와 유사하였으나 PLC-γ1의 발현은 방사선 및 5-FU지속성 정주병행군에서 가장 강한 양서의band를 보였으며 그 다음으로 방사선 및 5-FU 일시정주병행군, 방사선 단독군의 순서로 양성 band를 보였고, 그 외 군에서는 음성인 소견을 보였다. 이러한 면역조직화학염색상 점막의 손상으로 상피세포의 탈락을 보이는 상층부위에서 강한 양성의 염색상을 보였기 때문으로 생각된다. 결론적으로 방사선 조사 후 발생하는 세포 재생기전에 PLC-γ1및 ras 암 유전자 단백이 관여하는 신호전달체계가 중요한 역할을 할 것으로 추측되며 이들의 표현은 방사선과 5-FU를 병행하였을 때 5-FU투여방법에 따라 차이가 있는 것을 관찰할 수 있었다. 즉 재생이 활발한 부위에서 방사선과 5-FU12시간 지속성 정부 병행 시 가장 강한 양성을 보였고 5-FU를 일시 주사하여 병행하는 경우는 방사선 단독조사 시 보다도 발현정도가 약하였다. 이러한 결과는 조직학적 소견에서 재생이 활발하게 일어난 순서와 동일한 결과를 보여주었다. 도한 아직까지 작용기전이 밝혀지지 않은 PLC- δ1의 발현이 방사선과 5-FU를 병행한 군에서만 관찰되어 앞으로 PLC-δ1은 방사선과 5-FU의 상호작용기전을 연구하는데 중요한 역할을 할 것으로 사료되며, PLC-β1의 발현은 모든 실험 군에서 음성인 소견을 보여 방사선 조사 후 소장점막의 세포재생과정에서 PLC-β1가 관련된 신호전달기전이 관여하지 않음을 알 수 있었다.;Phospholipase C (PLC) isozymes have significant roles in signal transduction. PLC-γ1 is one of the key regulatory enzymes in signal transduction for cellular proliferation and differentiation. Ras oncoprotein is also involved in cell growth. We determined the biological significance of PLC and ras oncoprotein in regeneration following radiation and the effect of different modes of administration of 5-FU. To determine the effect of the administration mode of 5-FU on the regeneration of intestinal mucosa of rats following radiation, we compared the expression of PLC-γ1 and ras oncoprotein in six groups. Group I had no treatment. Group II received radiation (8 Gy) only. Group III received radiation (8 Gy) and 5-FU (150mg/Kg) continuous intravenous (iv) infusion for 12 hours. Group IV received radiation (8Gy) and 5-FU (150mg/Kg) continuous iv infusion for 12 hours. Group VI received only 5-FU (150mg.Kg) iv bolus injection. Through immunoblotting and immunohistochemistry, we examined the expression of PLC-γ1 and ras immunohistochemistry, we examined the expression of PLC-γ1 and ras oncoprotein in rat jejunum at 96 hours after radiation or 5-FU administration and at 120 hours after radiation and 5-FU administration. We also investigated the histological findings using hematoxylin and eosin stain. In the immunohistochemistry study, PLC-γ1 expression was highest in group III followed by groups II and IV in that order and was weakly positive in groups V and VI. There was no expression of PLC-γ1 in the control group. The expression of ras oncoprotein was the same as the PLC-γ1 expression for all groups. These results were confirmed by the histological findings regarding the mucosal regeneration. In the immunoblotting study, PLC-γ1 expression was highest in group III followed by groups IV and II in that order. This difference in the immunoblotting sudy was due to the strong expression of PLC-δ1 on the damaged surface epithelium rather than to its expression in the regeneration region as observed the immunohistochemistry study for group IV. The expression of PLC-δ1 was positive only in group V and VI, which received both radiation and 5-FU, and the expression of PLC-β1was negative for all groups. These studies suggest that PLC-γ1mediated signal transduction and ras oncoprotein have a significant role in mucosa regeneration after radiation, and that continuous iv infusion of 5-FU may induce active regeneration in intestinal mucosa following radiation. To confirm these effects of the 5-FU continuous infusion radiation. To confirm these effects of the 5-FU continuous infusion, further study will be needed. PLC-δ1 may have an important role in the interaction between radiation and 5-FU.