골관절염의 유전자 치료

Abstract

골관절염은 보존적 치료 방법과 다양한 수술적 치료 방법이 있지만 다른 난치성 질병과 마찬가지로 보다 근원적인 대안이 필요한 질병 중 하나이다. 최근들어 matrix metalloproteinases(MMPs) 증가나 tissue inhibitors of metalloproteinase(TIMPs)와의 균형 소실이 골관절염의 주된 병태조절인자의 하나로 밝혀지고 있고, 골관절염 관련 인자들에 관한 유전자치료의 실험적 연구가 시도되고 있으나 아직까지 어느 인자의 유전자가 골관절염 유전자 치료를 위한 가장 좋은 선택인가에 관해서 알려진 바는 거의 없다. 또한 줄기세포(stem cell)는 지속적이고 안정적인 세포 증식과 분화 능력 때문에 유전자 치료 영역에서 다각도로 연구되고 있다. 본 연구에서는 TIMP-2 유전자를 이용한 골관절염의 유전자 치료를 위해 TIMP-2 유전자 이입 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)가 전달감염(transfection)과 발현(expression)에 효과적인지 알아보고 유도된 골관절염 동물모델에 유전자치료를 적용하고 관찰하여 골관절염 유전자 치료의 새로운 모델을 제시하고자 본 연구를 계획하였다. 골관절염 진행 억제에 관련된 것으로 알려진 TIMP-2 유전자를 목표유전자로 하여 MFG.IRES.puro retroviral vector에 클로닝(cloning)하였다. 우선 생체외 실험으로 TIMP-2와 보고유전자(reporter gene)인 green fluorolescence protein(GFP) 유전자를 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell)에 전달감염시키고 활막세포, 연골세포, 섬유아세포 등과 비교관찰하여 GFP와 TIMP-2 발현을 관찰하고 유전자 발현의 안정도(stability)를 알아보았다. TIMP-2 유전자 이입 중간엽줄기세포를 계대배양하여 토끼의 활막관절에 주입한 후 3일, 6일, 9일, 12일에 연골과 활액을 채취하여 TIMP-2의 발현양을 ELISA와 Western blot으로 측정하고 lacZ의 발현을 X-gal 염색을 통해 확인하였다. 실험적 동물 골관절염 모델의 제작을 위해 토끼 슬관절의전방십자 인대와 내측 반월판연골의 전각부를 절제한 후 관절운동과 체중부하를 통해 골관절염을 인위적으로 유도한 후 관절의 조직표본을 관찰하고 생화학적 측정을 통해 골관절염의 모델로서 합당한가 알아보았다. 이 유도된 동물 골관절염에 TIMP-2유전자 이입 중간엽줄기세포를 적용하여 골관절염 치료효과와 가능성을 알아보았다. 연구결과로 각 세포주에서 ELISA로 측정한 TIMP-2 Secretion은 대조군인 NIH3T3에서는 223ng/106 cells/ml/24 hrs, 활막세포에서는 391ng/106 cells/ml/24 hrs, 연골세포에서는 256ng/106 cells/ml/24 hrs, MSC에서는 932ng/106 cells/ml/24 hrs, 섬유아세포에서는 2,000ng/106 cells/ml/24 hrs로 섬유아세포에서 가장 많이, 중간엽줄기세포에서 두번째로 많이 발현되었으나 mean fluorolescence intensity(MFI)로 본 안정도에 있어서는 중간엽줄기세포에서 15일까지 안정된 발현을 보였다. 계대배양한 중간엽줄기세포의 생체내 주입후 측정한 TIMP-2의 양은 주입 후 3일, 6일에 비해 9일 이후 급격히 떨어지는 것으로 나타났다. 토끼의 골관절염 유도 모델에서는 조직학적 변화는 6주 이후에, 생화학적 변화는 3주 이후에 나타나기 시작하여 활액의 양, 교원질의 발현, 제 2형 교원질은, MMPs는 점차 증가하며 TIMPs는 점차 감소하는 변화가 관찰되었다. 골관절염 모델에서의 TIMP-2 유전자 이입 중간엽줄기세포 주입한 후 12일째 대조군에 비해 조직 소견과 활액량 등으로 판단할 때 골관절염의 진행이 억제된 소견을 관찰할 수 있었다. 이상의 결과에서 중간엽줄기세포는 비교적 효과적인 유전자 전달감염과 발현을 보이며 계대배양시 안정적인 분비를 보이므로 골관절염 유전자 치료에 유용한 세포주로 생각된다. 또한 TIMP-2유전자는 골관절염 유전자치료의 유용한 수단으로 생각되며 동물 골관절염 유도 모델에서의 TIMP-2유전자 치료 결과는 향후 TIMP-2유전자 치료를 인간 골관절염 치료에 적용하는데 지침을 마련해줄 것으로 기대할 수 있겠다. 그러나 중간엽줄기세포를 이용한 TIMP-2 유전자 치료는 생체 관절에 주입시 TIMP-2발현이 점차 저하되므로 이의 보완을 위한 연구가 필요한 것으로 사료된다.;Osteoarthritis is one of the intractable disease which needs ultimate alternatives therapy because the cartilage has very limited intrinsic healing capacity. Recently, increase of matrix metalloproteinases(MMPs) and loss balance of tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMPs) found as one of main pathophysiological regulator of oasteoarthritis. And stem cells are emerging as a novel therapeutic approaches of gene therapy because of the characteristics of self-renewal and multi-lineage differentiation. Many researchers tried out experimental research of gene therapy about related factors of oasteoarthritis but the best selected target gene for oasteoarthritis is unknown. On this research, I planned to develop the gene therapy model of oasteoarthritis by evaluating efficacy of mesenchymal stem cells in gene transfection and expression, applying gene therapy into induced animal arthritic model using TIMP-2 gene. To deliver TIMP-2 as a target gene, I cloned on MFG.IRES.puro retroviral vector. At first in vitro, transfect TIMP-2 and green fluorolescence protein(GFP) gene as a reporter gene with several cell lines like synoviocyte, chondrocyte, fibroblast, and mesenchymal stem cell to observe GFP and TIMP-2 expression on each cell and to find the stability of gene expression. In vivo, cultured mesenchymal stem cells were injected into the knee joints of New Zealand white rabbit and extract the cartilage and synovial fluid after 3, 6, 9, and 12th day then measure the amount of expression of TIMP-2 by ELISA and confirmed the expression of lacZ through X-gal staining. For induced animal oasteoarthritic model, I removed cruciate ligament and anterior part of medial meniscus. Applied TIMP-2 gene transfected mesenchymal stem cells into these induced arthritic models to find out the possibility of curative effect. As a result, TIMP-2 secretion on each cell strain measured by ELISA, NIH3T3 which is control group was measured 223ng/106cells/ml/24hrs, synoviocyte was 391ng/106cells/ml/24hrs, chondrocyte was 256ng/106 cells/ml/24hrs, mesenchymal stem cell was 932ng/106cells/ml/24hrs, and fibroblast was measured 2,000ng/106cells/ml/24hr. It was expressed mostly at fibroblast, then second mostly at MSC but observing stability by mean fluorolescence intensity we could observe stable secretion up to 15days at stem cell line. The amount of TIMP-2, which was the measurement of after injecting subcultured stem cells in vivo, was rapidly decreased after 9 days compared with after 3, and 6 days of injection. I could observe histological change of induced animal oasteoarthritic model appeared after 6 weeks, biochemical change started to appear after 3 weeks. Histologic finding of TIMP-2 delivered mesenchymal stem cell treated osteoarthritic knee joint showed less degeneration of cartilage. In conclusion, of this research, mesenchymal stem cell was found capable delivering therapeutic genes such as TIMP-2 and showed relatively effective expression. And TIMP-2 gene delivered stem cell intraarticular injection could be a valid therapeutic modality for osteoarthritis. However TIMP-2 expression by gene delivered mesenchymal stem cell was keep decreasing when we injected into knee joint. Therefore, there must be a supplement research to improve this limit of in vivo study.