Arthrobacter simplex의 steroid-1-dehydrogenase의 정제 및 특성 연구

Abstract

콜레스테롤 등 각종 스테로이드 분해능을 가진 Arthrobacter simplex는 스테롤 측쇄분해 효소계와 핵분해 효소계를 모두 가지고 있지만 특히 A환의 탄소 1,2위치에 이중결합을 도입하는 ￠1-dehydrogenase의 활성이 뛰어나 효과가 증진된 corticoid 약물제조에 이용되어 온 중요한 균주이다. 본 연구에서는 그 중요성에도 불구하고 아직까지 알려진 바가 별로 없는 효소의 유도, 정제 및 각종 특성 등에 관해 연구하였고 유전자의 클로닝을 시도하였다. 스테로이드 존재하에서 발현되는 유도효소인 ￠1-dehydrogenase의 유도기작을 검토하여 측쇄가 없거나 짧은 3-keto-4-ene구조의 스테로이드를 대수증식기 초기에 0.01%의 농도로 첨가하여 15시간 전후로 유도하고 단백질을 분리 정제하였을 때 발현된 효소의 종류는 동일하였지만 그 양은 hydrocortisone으로 유도한 쪽이 많음을 확인하였다. 효소가 유도된 세포를 회수하여 glass bead의 마쇄를 이용한 bead beater를 사용하여 세포를 파쇄시키고 효소를 가용화시킨 후 streptomycin sulfate처리, DEAE-cellulose ion exchange column, phenyl-sepharose hydrophobic column, testosterone-agarose affinity column 등 세 단계의 column chromatography를 거쳐 13%의 수율로 123배 정제하였다. Native gel electrophoresis 및 SDS-PAGE로서 효소의 정제도를 확인하였고 nitroblue tetrazolium을 이용한 gel상에서의 효소활성 염색 band와 단백질 염색에 의한 band가 일치하여 정제된 단일 band의 단백질이 ￠1-dehydrogenase임을 확인하였다. Sephacryl S-200 column chromatography로 자연상태 효소의 분자량을 추정한 결과 100,000이었고 SDS-PAGE로 추정한 변성된 단백질의 분자량은 98,000이었다. 이 결과는 Arthrobacter simplex의 ￠1-dehydrogenase가 단일 subunit로 구성되어 있음을 나타낸다. 정제된 효소에 대한 항체를 토끼에서 제조하여 immunoblotting방법으로 98,000에 해당하는 단백질에 대한 항체가 생성되었음을 확인하였다. 정제된 ￠1-dehydrogenase는 다양한 스테로이드를 기질로 ￠1-dehydrogenation산물을 생성할 수 있었고 측쇄가 없는 3-keto-4-ene구조의 androstenedione을 가장 높은 효율로 전환하였다. C-17측쇄와 17-OH기 및 다른 위치의 ?OH기들은 효소작용에 장애를 나타내었다. androstenedione에 대한 Km값은 74mM, Vmax는 20nM/min이었고 hydrocortisone에 대한 Km값은 294mM, Vmax는 5.9nM/min이었다. 효소의 최적 반응 온도 및 pH는 각각 35℃, pH9.0이었으며 pH 5-10, 20-35℃에서 비교적 안정하였고 그 이상의 온도에서는 급격히 활성이 저하되었다. 효소의 활성을 저해하는 물질로는 Cu2+, Hg2+, Fe3+, Mo6+, EGTA, estradiol류 등이 있었고 그 중 b-estradiol은 competitive inhibitor로 작용하였다. 각종 화학변형 시약등 중 ?SH기를 저해하는 p-hydroxymercuribenzoate, iodoacetamide 등이 효소활성저해 및 기질 보호효과를 나타내었다. 정제된 분자량 98,000의 효소 외에 또 하나의 효소 활성이 gel filtration column chromatography 과정에서 발견되었는데 native gel상에서의 활성염색의 위치가 이미 정제된 효소와는 상이하다는 사실과 각종 스테로이드에 대한 기질특이성에서 차이를 보인다는 사실로부터 별개의 효소라고 추정하였다. 조효소액을 100,000xg에서 90분간 초원심분리하여 막과 세포질을 분리한 후 효소활성측정, native gel electrophoresis와 활성염색, 분자량 90,000인 효소에 대한 항체를 이용한 또 하나의 활성은 세포질내의 가용성효소, 혹은 좀 더 약한 막결합효소라고 추정하였다. Arthrobacter simplex의 genomic library를 lgt11 vector를 사용하여 작성하고 토끼에서 형성된 항혈청으로 immuniscreening하여 양성클론을 찾아내었다. 3차 screening을 거쳐 30,000개의 plaque중 5개의 양성 클론을 순수분리하였고 IPTG 존재하에서 liquid lysate를 만들어 4-androstene-3,17-dione을 기질로 ￠1-dehydrogenase의 활성을 조사한 결과 그 중 한 클론인 A2에서 1,4-androstadiene-3,17-dione의 반점이 나타나 ￠1-dehydrogenase가 클로닝되었다고 볼 수 있었다. lgt11에 들어간 A2의 insert크기는 7kb였는데 그것을 잘라내어 plasmid인 pSK에 subcloning하였을 때 원래 크기의 두 배인 12-14kb의 절편이 들어갔음을 확인하였다. 형질변환된 E.coli의 lysate에서는 효소활성을 확인할 수 없었다.;Arthrobacter simplex which is known to be able to degrade steroids and sterols has enzymatic activities of steroid side chain cleavage and steroid ring degradation. Among these steroid transforming activities of Arthrobacter simplex, ￠1-dehydrogenase which introduces a double bond into the 1,2 position of steroid ring A is valuable for the production of corticoid drugs having increased anti-inflammatory activity and decreased side effects. In spite of the industrial importance, there is a little information about enzyme. In this study, in order to gain the insight into ￠1-dehydrogenase activity the mechanism of the induction, purification and characterization of the enzyme was investigated and the cloning of ￠1-dehydrogenase gene was attempted. Like other steroid transforming enzymes ￠1-dehydrogenase requires steroid inducers. Among many steroids tested, 3-keto-4-ene steroids with no or short C-17 side chain showed high level of induction. The optimum induction was achieved by the addition of 0.01% of hydrocortisone at the early log phase followed by 15-hour of further cultivation. Enzymes purified from both cholesterol and hydrocortisone induced cells were identical, but the level of enzyme activity was higher in the hydrocortisone induced cells. Solubilized enzyme was obtained after centrifugation of hydrocortisone induced cell homogenates prepared by vigorous agitation with glass beads at 100,000 xg for 90minute. The enzyme was purified 123 fold after the three steps of chromatographic procedures and yield was 13%. The testosterone-agarose affinity column chromatography was critical for the successful purification of ￠1-dehydrogenase. Analysis of purified enzyme by native gel electrophoresis and SDS-PAGE indicating this enzyme behaves as a monomer. Purified enzyme converted various 3-keto-4-ene steroids into their corresponding products. The .￠1-dehydrogenated products. The efficiencies of conversion depend upon their chemical structures, especially the length of the side chain, C-17 and C-11 hydroxyl groups. The Km values for 4-androstenedione, the most favorable substrate, and hydrocortisone was 74mM, 294mM, respectively. The optimum temperature and pH of the enzyme reaction were 35℃ and pH 9.0 respectively and the enzyme was relatively stable between 20-30℃ and pH 5-10 after one hour of incubation. The enzyme activity was markedly inhibited in the presence of Cu2+, Hg2+, Fe3+, Mo6+ ions and EGTA and b-estradiol competitively inhibited the enzyme activity. Chemical modifications were attempted with several reagents such as p-hydroxymercuribenzoate, iodoacetamide which showed inhibition and substrate protection. This suggests that cysteine residue might be involved in the active site of enzyme. A single band protein from SDS-PAGE was isolated and injected into a rabbit and the production of the antibody against the enzyme was confirmed by western blot analysis. Unique enzyme that is different from the previously purified enzyme was isolated from the gel filtration chromatography of the eluate of DEAE-cellulose chromatography. These enzymes differ in substrate specificity and the mobilities on native gel when activity of the enzyme was stained with nitroblue tetrazolium in the presence of substrate. The subcellular distribution of the enzyme was investigated by comparing the enzyme activity between the insoluble membrane fraction and soluble cytoplasmic fraction after ultracentrifugation at 100,000 xg for 90 minutes. The results from the activity staining on native gel and western blot with the antiserum to 98,000 dalton is a membrane protein and another enzyme is a cytoplasmic or more weakly attached membrane protein. Genomic library of Arthrobacter simplex was constructed with lgt11 and screened for immunopositive clone with antiserum against the enzyme. From the 30,000 plaques, five immunopositive clones were obtained by the primary, secondary and tertiary screening. Liquid lysate of the positive clones were assayed for the enzymatic activity and in one positive l clone designated as A2 detectable amount of 1,4-androstadienedion was formed from 4- androstadienedione. This data indicates that DNA of ￠1-dehydrogenase was cloned. Insert DNA from clone A2 of 7kb was subcloned into plasmid pSK, but the size of the cloned fragment was 12-14 kb that do not contain EcoRI site. Probably two fragments were ligated and mutation occurred at the internal EcoRI site. The lysate of the transformed E.coli revealed no detectable enzyme activity. More experiments might required for the revolution of this problem.