Regulation of selenoprotein expression throughout cell cycle progression

Abstract

Hydrogen peroxide has been known to be a signaling mediator which takes part in protein and lipid oxidations. It has been proposed that fluctuations observed in the intracellular redox state during cell cycle progression could link oxidative metabolic process to cell cycle regulation. Mitochondria are the major source of intracellular reactive oxygen species (ROS). However the role of mitochondrial ROS on cell cycle progression has not been studied yet. Here we first report that mitochondrial ROS fluctuates during cell cycle progression and reaches highest levels at mitosis phase. Mitochondrial H2O2 and super oxides levels were measured by FACS analysis using Hyper-mito, a H2O2 sensitive mitochondria targeting vector and Mitosox, a well-known mitochondrial superoxide sensor. Mitochondrial H2O2 and superoxide levels were higher at mitosis phase compare to G1/S phase. We assumed cellular H2O2 levels can be controlled by antioxidant protein throughout cell cycle progression. Therefore we investigated the expression pattern of antioxidant protein such as glutathione peroxides (Gpx), peroxiredoxin (Prx) and thioredoxin reductase (TR) during cell cycle progression. We found through immunoblots analysis that all peroxiredoxins (Prxs) remains stable throughout cell cycle. Intriguingly, immunoblots showed the levels of Gpx1, Gpx4 and selenoprotein P decreased at mitosis phase and increased during mitotic exit to G1 phase in Hela and A431 cells while thioredoxin reudctase protein levels were not changed. Considering that Gpx1, Gpx4 and SelP are selenium containing proteins, we checked if selenium supplementation could compensate the reduction of Gpx and Sel P levels at mitotic cells. The expression of Gpx1, 4, and SelP protein levels were induced by selenium supplementation at all stage of cell cycle but were lower at mitosis phase than G1/S phase. Moreover the fractination experiment showed cytoplasmic Gpx1 protein decrease at mitotis phase whereas Gpx4 is mainly expressed in mitochondria and barely detectable in cytosol of Hela cells and a 80% of mitotic reductions occur in mitochondria and a 50% of mitotic reductions in cytosol compared to G1/S phase. However we found the levels of messenger RNA of Gpx1 and 4 are unchanged throughout cell cycle indicating the transcription of Gpx1 and 4 are not reduced at mitosis phase. We also demonstrated that proteosomal degradation pathway is less responsible for reductions of Gpx proteins at mitosis phase. In unsynchronized Hela cells turnover rate of Gpx1 and 4 was shorter than that of TR1 and Prx1. According to previous study, seleno protein can be devided in two group depending on sec location; Selenoprotein that have their sec on C-terminal end (Type 1) and selenoprotein that have their sec on middle of N-terminal region ( Type 2) selenoprotein. Here we propose that the translation of type 2 selenoproteins such as Gpx1, Gpx4 and SelP is inhibited at mitosis and that of type 1 selenoprotein such as TR1 and TR2 is not. The physiological consequence of differential translational regulation of selenoprotein throughout cell cycle remains to be investigated.;과산화수소는 단백질과 지질 산화 과정을 통한 신호 전달자로 작용한다고 알려져 있다. 세포 주기 진행 동안에 세포 내 산화-환원 상태의 지속적인 변동이 세포주기 조절을 위한 산화적 대사 과정과 연관될 수 있다고 제안되어 왔다. 미토콘드리아는 세포 내 활성 산소의 주요 공급자이다. 그러나 세포 주기 진행 동안에 미토콘드리아의 활성 산소의 역할에 대해서는 많은 연구가 되어 있지 않다. 본 논문에서 처음으로 세포 주기 진행 동안에 미토콘드리아의 활성산소가 지속적인 변동을 가지고 있고, 세포 주기 중에서 세포 분열기에서 그 양이 가장 많이 증가되어 있음을 알아냈다. 미토콘드리아의 H2O2와 O2·-의 양은 미토콘드리아에 위치하여 H2O를 감지하는 Hyper-mito와 미토콘드리아의 O2·-를 측정할 수 있는 Mitosox를 이용하여 세포 유속 분석기를 통해서 측정되었다. 그 결과 미토콘드리아의 H2O2와 O2·-의 양은 G1/S 단계보다 세포분열기에서 더 높다는 것을 알 수 있었다. 또한 H2O2의 양이 세포 주기를 진행하는 동안에 항산화 효소에 의해 조절될 수 있는지 알아보기 위해서 항산화 효소인 glutathione peroxides (Gpx), peroiredoxin (Prx) and thioredoxin reductase (TR)의 발현을 조사하였다. 그 결과, 세포 주기 동안에 모든 peroxiredoxins (Prxs)의 양이 일정하게 유지되었다. 흥미있게도, Gpx1, Gpx4 and selenoprotein 의 양은 세포분열기 단계에서 감소하고 mitotic exit단계에서 G1으로 가는 동안 증가되는 것을 관찰하였다. 반면, TR selenoprotein의 발현은 변화가 없는 것을 발견하였다. Gpx1, Gpx4 and SelP는 selenium을 포함한 단백질이므로, selenium의 공급이 세포 분열기에서 Gpx 와 Sel P의 양이 감소되는 것을 보상 작용할 수 있는 지을 조사하였다. 세포 주기의 모든 단계에서 selenium의 공급이 Gpx1, 4 그리고 SelP 의 발현이 증가함을 관찰하였고, 그러나 세포분열기에서 Gpx1, Gpx4와 SelP의 감소는 여전히 관찰되었다. 게다가 Hela 세포의 소기관 분리 실험에서 세포분열기 단계에서 세포질의 Gpx1은 감소되는 반면, Gpx4는 주로 미토콘드리아에서 발현되며, 미토콘드리아 Gpx4가 80% 감소와 세포질 Gpx4의 50% 감소를 됨을 발견하였다. 그러나, Gpx1과 Gpx4의 messenger RNA의 수준은 세포 주기 동안에 변화는 없었다. 또한 본 연구에서는 proteosomal 단백질 분해과정이 세포 분열기에서 Gpx 의 감소에 대해 중요한 역할을 하지 않는 것을 발견하였고, unsynchronized 세포에서 Gpx1 과 Gpx4의 반감기는 TR1과 Prx1보다 더 짧다는 것을 알 수 있었다. Selenoprotein을 Sec domain의 위치에 따라 Type1 (Cterminalend)과 Type2 (N-terminal region) 의 두 개의 그룹으로 분류할 수 있다. 본 연구 결과들을 통하여 우리는 Gpx1, Gpx4 그리고 SelP와 같은 type 2 selenoprotein의 translation은 세포 분열기에서 저해되고 TR1과 TR2와 같은 type 1 selenoprotein은 그렇지 않다는 것을 제안한다. 세포주기 동안 selenoprotein의 translation 조절의 생리적 중요성은 앞으로 조사가 더 필요하다.