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PKCβ/GSK-3β/NFATc1 axis in RANKL-induced osteoclastogenesis

Title
PKCβ/GSK-3β/NFATc1 axis in RANKL-induced osteoclastogenesis
Authors
신지혜
Issue Date
2012
Department/Major
대학원 생명·약학부생명과학전공
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
이수영
Abstract
Bone homeostasis is maintained by well-balanced action of bone-destructing osteoclasts and bone-forming osteoblasts in vertebrates. Imbalance between these two cells activity cause various bone diseases and osteoclasts are the usual cells which are responsible these disorders. Increased osteoclast numbers and activity is the result of unregulated signaling pathways which mediates survival of osteoclast precursor cells or differentiation and activation of osteoclasts. The two cytokines are the essential factors for osteoclast differentiation and function, M-CSF and RANKL. Here, I show that the GSK-3β inactivation upon receptor activator of NF-κB ligand (RANKL) stimulation is crucial for osteoclast differentiation and PKCβ is the regulator for GSK-3β by phosphorylating its inhibitory serine residue. Glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β) is a serine/threonine kinase originally identified as a regulator of glycogen deposition. Overexpression of constitutively active GSK-3β mutant attenuated RANKL-induced osteoclastogenesis, whereas expression of the catalytically inactive GSK-3β or small interfering RNA (siRNA)-mediated GSK-3β silencing enhances osteoclast formation. When GSK-3β was inhibited with its pharmacological inhibitors, osteoclast differentiation was increased in response to GSK-3β inhibitors dose-dependently. I also showed that overexpression of constitutively active GSK3β mutant in BMMs inhibited RANKL-mediated NFATc1 induction and Ca2+ oscillations. I also generated transgenic mice expressing the GSK3β-S9A mutant which show an osteopetrotic phenotype due to impaired osteoclast differentiation. Protein kinase C (PKC) proteins are ubiquitously expressed in various cell types and have critical roles in many cellular responses. PKCβ is known to phosphorylate GSK-3β preferentially in cytokine signaling pathways. In BMMs, RANKL-induced phosphorylation and inactivation of GSK-3β is blocked by inhibition of PKCβ with its pharmacological inhibitors or siRNA. NFATc1 proteins are robustly induced by NFATc1 autoamplification activated by Ca2+/calcineurin signaling during osteoclast differentiation. Impaired PKCβ activity led to failed NFATc1 induction and osteoclast formation. When RANKL-induced Ca2+ was eliminated with BAPTA-AM, phosphorylation of GSK-3β was completely abrogated. As a therapeutic target for bone diseases like osteoporosis which is due to uncontrollably increased osteoclast activity, PKCβ inhibitor efficiently protected bones from RANKL-induced bone resorption. In this study, I demonstrated that there are PKCβ/GSK-3β/NFATc1 axis which is crucial to RANKL-stimulated osteoclast differentiation.;척추동물의 운동과 골격을 유지하는 조직인 뼈는 인체에선 가장 단단한 조직 중 하나이다. 이러한 뼈의 항상성은 뼈를 흡수하는 세포인 파골세포 (Osteoclast)와 뼈를 형성하는 세포인 조골세포 (Osteoblast)의 균형을 통해 유지된다. 이러한 균형이 깨어졌을 때, 뼈의 항상성이 무너지고 결과적으로 여러 질병을 일으키게 된다. 이러한 질병엔 골다공증, 골연화증 (구루병) 등이 있고 이러한 질병은 생명엔 크게 지장이 없을지라도 생활하는 데 있어서는 커다란 지장을 초래하고 삶의 질을 심각하게 저해할 수 있다. 파골세포의 생성, 분화와 활동을 조절하는 두 가지의 Cytokine인 대식세포콜로니자극인자 (M-CSF)와 파골세포분화촉진인자인 RANKL에 의해 전달되는 세포신호전달과정에 대한 연구가 활발히 이루어져 오고 있다. 본 연구에서는 이러한 세포신호전달과정의 조절단백질 중 글리코겐 합성효소 인산화효소인 GSK-3β와 단백질인산화효소C 베타인 PKCβ가 파골세포 핵심전사인자인 NFATc1 (Nuclear factor of activated T cell cytoplasmic 1)을 조절하는 기작에 대해 새로이 밝혔다. GSK-3β는 세린, 쓰레오닌 인산화효소로 여러 세포신호전달과정에서 전사인자를 직접적으로 조절한다고 알려져 있다. GSK-3β의 활성형 돌연변이를 과발현 하였을 때 RANKL에 의해 유도되는 파골세포의 형성이 저해되었고, GSK-3β의 비활성형 돌연변이를 과발현 하거나, 짧은 간섭 RNA를 통해 GSK-3β의 발현을 억제하였을 때에는 파골세포의 형성이 촉진되었다. 또한 화학적 억제제를 이용하여 GSK-3β의 활성을 억제하였을 때에도 마찬가지로 농도에 따라 파골세포의 분화가 촉진되는 것을 관찰하였다. 이 연구에서는 GSK-3β의 활성형 돌연변이의 과발현을 통해 RANKL에 의해 유도되는 NFATc1의 발현과 세포 내 칼슘의 oscillation이 억제되는 것을 증명하였다. 또한, GSK-3β의 활성형 돌연변이를 과발현하는 유전자 조작 생쥐를 만들어, 그 골수에서 유래한 단핵구/포식세포를 꺼내어 파골세포로의 분화를 유도하였을 때 분화가 억제되는 것을 보았고, 골밀도를 검사하였을 때는 정상 생쥐에 비해 골밀도가 증가해있는 것을 관찰할 수 있었다. 위에서 밝힌 GSK-3β를 인산화하는 것으로 밝혀진 여러 인산화 효소 중 PKCβ는 여러 다양한 세포에서 발현되며, 많은 세포신호전달과정에서 중요한 전달자로서 작용하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 PKCβ의 화학적 억제제를 이용하여 PKCβ의 활성을 억제하였을 때, RANKL 처리에 의한 GSK-3β비활성화를 저해하였으며 NFATc1 단백질의 발현 또한 억제하였고, 파골세포의 형성도 효과적으로 억제하였다. 짧은 간섭 RNA를 이용하여 PKCβ의 발현을 억제하였을 때에도 화학적 억제제를 사용하였을 때와 마찬가지로 GSK-3β의 비활성화와 NFATc1의 발현 유도, 그리고 파골세포의 분화가 억제되는 것을 통하여PKCβ가 RNKL 신호전달계에서 파골세포의 분화를 조절하는 데에 중요한 역할을 하는 것을 볼 수 있었다. 생체 내에서의 PKCβ의 역할을 확인하기 위해 화학적 억제제를 RANKL과 함께 생쥐의 두개골 부위에 주입하여 두개골 뼈의 파괴 정도를 관찰하니 PKCβ의 화학적 억제제에 의해 RANKL에 의한 골밀도의 감소가 효과적으로 억제되는 것을 볼 수 있었다. 이러한 실험 결과를 종합하여 지금까지 알려져 있던 파골세포의 분화를 조절하는 세포신호전달계 외에 PKCβ/GSK-3β/NFATc1라는 축을 통해서도 파골세포의 분화가 조절된다는 것을 이 연구에서 밝히고 있다.
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일반대학원 > 생명·약학부 > Theses_Ph.D
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