Dactylomyces thermophillus의 대사산물에 관한 연구

Abstract

Polyketides, polymerization products of ketene（CH₂=C=O）, are mostly secondary metacolites of fungi. Even among the fungi, the ability to produce polyketides is not evenly distributed. They are relatively well characterized by organic chemists, because many of them are mycotoxins or antibiotics. However, the problem of polyketide biosynthesis has received little attention from biochemists, because of limited distribution and secondary nature of polyketide. Terremutin and terreic acid which belong to tetraketide were isolated from Aspergillus terreus. Terrin, another metabolite from A.terreus, belongs to pentaketide. Testing for stereospecific chemical reduction of 2-（6-carboxy-cis-2-hexenyl）-cyclopentane-1.3.4-trion with microorganisms, the author metabolite was accumulated in the culture broth of Dactylomyces thermophillus. This metabolite was isolated and characterized by determination of m.p., U.V. and I.R. spectrum. A mixed melting point determination with an authentic sample of terrein showed no depression. Its I.R. spectrum was also identical to that of authentic terrein. In another experiment, D.thermophollus was inoculated into a soybean destrose medium and incubated without adding 2-（6-carboxy-cis-2-hexenyl）. At earlier stage of fermentation, a main accumulation product was isolated and characterized by determination of m.p., U.V., I.R. and N.M.R. spectrum. Interpreting all of data given above, it is now clear that this metabolite is terremutin. When the culture broth was kept going on incubation for a prolonged period, it was observed that the accumulated terremutin at earlier stage of incubation was gradually disappeared. And a less polar new metabolite was accumulated at the expense of terremutin at later stage of incubation. This metabolite was isolated and purified to needle crystals colored in pale yellow. It was determined m.p., U.V., I.R. and N.M.R. spectrum. This compound was identical with terreic acid, the sublimation product of terremutin in every respect. During incubation of D.thermophillus in the soybean dextrose medium, the accumulation patterns of terremutin and terrein were significantly affected with aeration and incubation temperature. When a peptone dextrose medium was chosen, terrein was accumulated. When a mineral dextrose medium was chosen, none of the two metabolites were detected. In order to clearify the biosynthetic route of terreic acid, D.thermophillus was incubated under various condition. The accumulated metabolites in the culture broth were extracted and detected under a U.V. Scanner after seperation on a sillica gel TLC plate. Every metabolite which absorbs U.V. light was isolated and its U.V. spectrum was checked. The absorption spectrum which is a characteristic of 6-hydroxy-2,5-toluquinone, a presumable precursor of terreic acid, was not recorded. From this fact and the metabolic patterns of terremutin and terreic acid, the author proposed a modified new biosynthetic route of terreic acid. Examining the experimental results obtained from the fermentation of D.thermophillus, it was clear that even in the same medium the accumulation ratio of terremutin and terrein was subtly changed by change of aeration and temperature. Furthermore, substitution of soybean meal with peptone abolished terremutin, and terrein alone was accumulated. Judging from these evidences, it is conceivable that biosynthetic route of terremutin and terrein are much common at earler stage polymerization of acetyl unit to polyketide by sharing a common enzyme system, and the branching point of two metabolites synthesis is an intramolecular aldol condensation of tetraacetate unit or of pentaacetate unit. If this is the case, a tetraacetate unite makes 6-methylsalicylic acid, and eventually is converted to terremutin. On the other hand, therrein would be a final product of pentaacetate unite via orsellinic acid or isocoumain route.;Ketene（CH₂=C=O）의 重合體인 polyketide類는 그 大部分이 곰팡이의 二次代謝産物이나 普遍的인 것은 아니고 限定된 分布의 것이다. 이들중에는 mycotoxin또는 抗生物質인 것이 많기 때문에 物質自體에 대한 分離, 確認은 有機化學者들에 의하여 比較的 잘 이루어져 있으나 生合性에 關한 硏究는 늦어지고 있다. Acetyl unit 4個가 縮合한 tetraketide類에 屬하는 terremutin과 terreic acid는 Aspergillus terreus에서 分離되었고 이중 terreic acid는 gram陽性菌, gram陰性菌, 곰팡이, Trichomonas vaginalis에 强力한 抗菌作用이 있다는 것이 알려져 있다. Penraketide인 Terrein은 Aspergillus屬과 Penicillium屬에서 分離되고 있다. 著者는 微生物을 利用한 化學物質의 特異的인 還元反應을 檢討하던 중 새로히 Dactylomyces thermophillus의 培養液中에서 多量의 代謝産物이 蓄積되는 것을 發見하고 이것들을 分離 確認하였다. 먼저 D.thermophollus의 soybean dextrose media의 culture broth중에 2-（6-carboxy-cis-2-hexenyl）-cyclopentane 1,3,4-trione을 添加하여 振탕培養을 繼續함으로써 代謝産物을 分離 精製하였다. 이 物質의 m.p.는 124-125°, U.V.spectrum의 極大吸收致 λmax:283nm（H₂O）分子吸光係數 ε=24,300 （分子量 154）,λmax:276nm（95% ethanol）을 나타내었고, I.R.spectrum의 νmax（KBr）: 3400, 1700, 1640, 1570, 965㎝-¹을 나타내었다. 다시 terrein의 標準品과 混融試驗 을 하였을 때 融點降下를 볼 수 없었고 標準品의 I.R.spectrum과 比較하였을 때 spectrum의 差異를 볼 수 없었다. D.thermophollus를 soybean dextrose media中에 移植하고 2-（6-carboxy-cis-2-hexenyl）-cyclopentane-a,e,4-trione을 添加하지 않고 振탕培養을 하였을 때 培養初期에 蓄積되는 代謝産物을 分離積製하였다. 이 代謝産物은 terremutin으로 確認되었다. 卽 이 物質의 m.p.는 145~146°이었고, U.V.spectrum은 中性 methanol中에서 273nm에서 强한 吸收帶, 309nm에서 shoulder性 吸收帶를 나타내었다. 0.01N HC1溶液中에서는 最大吸收値 λmax:273nm（ε:12000）이었고 0.01N HC1溶液中에서는 λmax:309nm （ε:20000）을 나타내었다. I.R.spectrum은 νmax（KBr）:3290, 3090, 1640, 1400, 1340, 1280, 1260, 1230, 1125, 1090, 1040, 1020, 900, 865, 820, 785, 710㎝-¹이었고 D₂O중 N.M.R.의 signal은 τ値로서 7.9（s, 3H）, 5.9（m,1H）, 5.6（m,1H）,4.8（s,1H）을 나타내었고 triethylamine 한방울을 伽했을 때 τ.4.8（s.1H）의 signal은 5.2로 shift하였다. 이 物質을 다시 20% palladium carbon으로 接觸酸化昇華시킨 黃色物質은 terreic acid인 것을 알 수 있었다. 以上과 같은 事實에 立脚하여 이 代謝産物은 terremutin인 것을 確認할 수 있었다. Terremutin 生産培養液을 계속 振탕培養하면 培養液中의 terremutin量은 漸次 減少되고 terremutin보다 極性이 적은 새로운 物質이 蓄積되는 것을 發見하고 이 物質을 Chromatography로 分離하였다. Benxene,pet.ether로 再結晶할 때 m.p.125~126°를 나타내었으며 pyrex glass tube속에서 減壓 加溫 昇華시킬 때 靑黃色의 針狀結晶을 얻었다. U.V.spectrum의 λmax（MeOH）:215nm（ε=8510）,315nm（ε=6310）을 나타내었고I.R.spectrum의 νmax（KBr）은 3300, 1690, 1655, 1629, 1380, 1370, 1350, 1305, 1250, 1220, 1200, 1135, 1035, 990, 865, 836, 789, 760, 700㎝-¹을 特異的으로 읽을 수 있었다. N.M.R spectrum은 CDCI₃중에서 τ2.9（s,1H,OH proton）, 6.0（s,2H,epoxide protons）, 7.9（s, 3H, methy1 protons）를 나타내었다. 또 이 物質은 Terremutin의 酸化 昇華物과 同一하였음으로 terreic acid임이 確認되었다. D.thermophillus를 soybean dextrose media에서 培養할 때 여러가지 培養條件中 aeration의 多寡 및 溫度에 따라 terremuttin과 terrein이 各各 單獨 또는 混合物로 生成되었었다. Soybean dextrose media 代身 Peptone dextrose media중에서는 terremutin의 生産은 볼 수 없었고 terrein만이 蓄積되었으며 또 mineral dextrose media로 培養하면 菌體는 잘 자라나나 terremutin과 terrein의 蓄積은 볼 수 없었다. Terreic acid의 生合成經路를 糾明할 目的에서 여러가지 條件아래서 D.thermophillus를 培養하고 培養過程中 時間經過에 따라 蓄積되었다가 消滅하는 代謝産物들을 따로 따로 分離하고 이 代謝産物들의 U.V.吸收 spectrum을 檢討하여 본 結果 terreic acid가 生合成 될 수 있는 假想的인 前驅物質 6-hydroxy-2.5-toluquinone의 吸收spectrum은 찾아 볼 수 없었고 terremutin만이 特異的으로 蓄積되었다가 terreic acid의 蓄積量에 比例하여 消滅되는 事實 等에 비추어 다음과 같은 terreic acid의 生合成經路를 새로이 修正하여 提出한다. Terrin의 生合成經路에 대해서는 orsellinic acid系物質이 中間體라는 假設과 isocoumarin이 中間體라는 假設이 있으나 兩學說 모두 pentaketide에서 由來된 것으로 보고 있다. 著者의 實驗結果에 따르면 同一培地中에서 aeration과 근소한 培養溫度條件의 變化等에 따라 terremutin과 terrein의 生産比率이 달라진다. 또 같은 aeration 條件과 溫度條件에서도 培養液中에 soybean meal代身 peptone을 添加하면 terremutin의 蓄積은 볼 수 없었고 terrein만 蓄積되었다. 이와같은 事實을 감안하면 terremutin과 terrein의 生合成은 一連의 共通酵素系에 의해 polyketide로 重合되는 過程에서 teraacetate unit가 分子內 aldol 縮合을 하느냐 또는 pentaacetate unit가 縮合을 하느냐에 따라 前者의 경우 6-methyl salicylic acid를 거쳐 terremutin 및 terreic acid로 轉換되고 後者의 경우는 orsellinic acid type의 中間體를 거쳐 terrein으로 轉換되는 것으로 생각된다.