The Functions of a DNA-binding transcription factor, BZEL in Somatic Hypermutation of Immunoglobulin genes

Abstract

Upon exposure to antigen, naïve B cells are activated and some of the activated B cells migrate to follicle area, and together with T helper cells and follicular dendritic cells, form germinal center. In the germinal center, somatic hypermutation (SHM) occurs to diversify Immunoglobulin (Ig) genes. SHM introduces non-templated point mutations in the rearranged Ig variable region and is triggered by activation-induced cytidine deaminase (AID), an enzyme which catalyzes conversion of cytosine to uracil. Subsequently, U:G mismatch generated by AID is recognized by the repair machinery, which mediates an error-prone repair process leading to the generation of mutations. Many competent mechanisms concerning SHM have been proposed, but the mechanism responsible for the targeting AID specifically to immunoglobulin (Ig) loci has not been elucidated. During the process of characterizing the function of a novel transcription factor, BTB-zinc finger protein expressed in effector/memory lymphocytes (BZEL), I found the importance of BZEL in SHM. BZEL was recently identified in our lab as a bric-à-brac, tramtrack, broad-complex (BTB)-zinc finger (ZF) protein specifically expressed in effector and memory lymphocytes. BZEL acts as a sequence-specific transcriptional repressor by binding to DNA through the zinc-finger domain and interacting with corepressors through the BTB domain. To define the functions of BZEL, I searched for the proteins that bind to BZEL by yeast two-hybrid screening of murine T cell lymphoma library, and several proteins, including proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and DeSUMOylating Isopeptidase-1(DeSI-1), were detected as binding partners of BZEL. In the first part of this thesis, I studied the biological meaning of the BZEL-PCNA interaction. Since PCNA is involved in translesion synthesis during SHM in germinal center B cells and BZEL is specifically expressed upon B cell activation, I tested the possibility whether BZEL is involved in SHM. I investigated whether BZEL interacts with components of SHM, such as PCNA, activation-induced cytidine deaminase (AID) and replication protein A (RPA) and found that BZEL coimmunoprecipitates with all three proteins tested. Moreover, upon analysis of Igκ locus by using a chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and an electrophoretic mobility shift assay (EMSA), BZEL bound to cis-elements such as matrix-associated region (MAR), 3’Enhancer (3’E) and intronic enhancer (iE), previously shown to be important for targeting of AID to immunoglobulin locus during SHM. These results suggest that BZEL functions as a targeting factor of AID to Ig locus. Moreover, to definitely show that BZEL is required for SHM, DT40 cell line, in which the zbtb46 gene encoding BZEL was deleted, was established. In BZEL-/- DT40crel cells, SHM frequency was significantly reduced compared to wild type cells indicating that BZEL is necessary for SHM. Based on these results, I propose a following model for SHM process. BZEL binds to specific sequences in the cis-elements of Ig loci and subsequently recruits AID, RPA and PCNA to Ig locus through direct associations. In turn, AID recruited to Ig loci by association with BZEL, interacts with RNA polymerase II and introduces mutations on the variable region in a transcription-dependent manner. At the same time, PCNA recruited to Ig loci by binding to BZEL recruits error-prone DNA polymerase to allow mutations during repair. Therefore, BZEL serves as a platform on which key proteins in SHM, such as AID, RPA and PCNA, are assembled specifically in Ig loci. In second part of this thesis, I describe the biochemical characterization of DeSI-1, detected as a binding partner of BZEL in yeast two-hybrid screening. A homology search revealed that DeSI-1 belongs to a group of proteins designated as PPPDE (Permuted Papain fold Peptidases of Ds-RNA viruses and Eukaryotes) which were predicted to function as deubiquitinating peptidases. In addition to DeSI-1, one more PPPDE family of proteins, which I named DeSI-2, occurs in mouse. DeSI-1 and -2 are expressed in most of the mouse tissues including secondary lymphoid organs. Subcellular localization analysis revealed that DeSI-1 was present throughout the cytoplasm and nucleus, whereas DeSI-2 was localized mainly in the cytoplasm. Since DeSI-1 was identified as a BZEL-binding protein and BZEL is ubiquitinated or sumoylated, I examined whether DeSI-1 catalyzes the deubiquitination or desumoylation of BZEL and found that the level of ubiquitinated BZEL was not affected by DeSI-1 overexpression but, the sumoylation status of BZEL was markedly reduced upon expression of DeSI-1. Furthermore, in in vitro desumoylation assay employing the purified DeSI-1, BZEL and SUMO proteins, DeSI-1 also showed deconjugation activity for sumoylated BZEL. In addition, upon testing the substrate specificity of DeSI-1, PML and ΔNp63, two previously established substrates of the sentrin-specific protease (SENP) family of proteins, were not desumoylated by DeSI-1, suggesting that SENP and DeSI-1 have different substrate specificities. These findings reveal the presence of a novel class of desumoylases in mammals, in addition of the one previously known the SENP family.;naïve B cell은 항원 노출에 의해 활성화되고 이들 중 일부는 follicle지역으로 이동하여 follicular helper T cell과 follicular dendritic cell과 함께 germinal center를 형성하게 된다. 이곳에서 B cell의 immunoglobulin 유전자에 체성과변이 (somatic hypermutation, SHM)에 의한 항체의 다양성이 유도된다. 체성과변이는 재배열된 immunoglobulin variable유전자에 점 돌연변이가 형성되는 것이며, 이는 cytosine을 uracil로 변환시키는 activation induced deaminase (AID)라는 효소에 의해 유도된다. AID에 의해 만들어진 U:G mismatch는 돌연변이를 허용할 수 있는 error prone repair machinery에 의해 인지되어 repair가 된다. AID가 유도하는 체성과변이에 대한 기작은 비교적 잘 정립되어 있지만 AID가 Immunoglobulin 유전자에 특이적으로 targeting되는 기작에 대해서는 알려진 바가 없다. 본 실험실에서는 BTB-Zinc Finger 단백질군에 속하고 effector와 memory lymphocytes에서 발현이 높은 새로운 단백질, BZEL의 기능을 연구하였다. BZEL은 DNA 서열을 특이적으로 인지하는 전사인자로 Zinc Finger domain을 통해 DNA에 결합하고, BTB domain을 통해 co-repressor와 결합한다. BZEL의 기능을 연구하기 위해서 murine T cell lymphoma cDNA library를 이용하여 BZEL 결합 단백질을 Yeast two hybrid assay를 통해 탐색하였고 그 결과 PCNA와 DeSI-1을 포함한 몇몇의 단백질을 BZEL의 binding partner로 확인하였다. 논문의 첫 번째 장에서는 BZEL과 PCNA의 결합이 가지는 생물학적 의미에 대해 연구하였다. PCNA는 germinal center B cell의 체성과변이 과정에서 translesion synthesis에 작용함이 알려져 있으며 BZEL은 B cell의 활성화 신호에 의해 발현이 유도되므로 BZEL이 체성과변이 과정에서 작용할 것이라 예상하였다. 먼저, BZEL과 체성과변이에 작용하는 인자인 PCNA, AID, RPA와의 결합을 확인하였고 BZEL이 이들 세 단백질 모두와 coimmunoprecipitation되는 것을 확인하였다. 게다가 체성과변이 시에 immunoglobulin locus로 AID의 targeting에 중요한 것으로 알려져 있는 cis-element에 BZEL이 결합함을 ChIP assay와 EMSA를 통해 확인하였다. BZEL이 체성과변이에 필요한지 보다 명확히 확인하기 위해서 DT40 cell을 이용하여 BZEL을 encoding하는 zbtb46 gene을 제거한 결과 wild type cell에 비해 BZEL-/-cell에서 체성과변이가 현저히 감소하였음을 확인하였다. 이는 BZEL이 체성과변이 과정에서 반드시 필요한 단백질임을 시사한다. 이러한 결과를 바탕으로 체성과변이에 대한 다음과 같은 모델을 제시하였다. BZEL이 immunoglobulin loci의 cis-element에 결합한다. 이어서 직접 결합을 통해 AID, RPA, PCNA를 immunoglobulin 유전자로 recruit한다. 결과적으로 BZEL과의 결합을 통해 immunoglobulin loci로 recruit된 AID는 RNA polymerase II와 결합하여 transcription dependent manner로 variable region에 돌연변이를 유도하게 된다. 동시에 BZEL과의 결합을 통해 immunoglobulin loci로 recruit된 PCNA는 error-prone DNA polymerase를 recruit해서 mutation을 허용하는 repair를 가능하게 한다. 따라서 BZEL은 SHM에서 핵심적인 단백질인 AID, RPA, PCNA에 immunoglobulin loci에 특이적으로 결합 할 수 있도록 platform역할을 하는 단백질임을 규명하였다. 논문의 두 번째 장에서는 yeast two hybrid screening에서 BZEL 결합 단백질로 확인된 DeSI-1의 생화학적 기능을 연구하였다. DeSI-1은 상동성 조사를 통해 papain fold peptidases인 PPPDE family의 member로 deubiquitinating peptidases로 작용할 가능성이 있을 것으로 보고되었다. DeSI-1과 더불어 mouse에서 PPPDE family 단백질이 하나 더 존재하는 것을 확인하고 이를 DeSI-2라 명명하였다. DeSI-1, 2는 2차 면역 기관을 포함한 대부분의 조직에서 발현되고 DeSI-1은 세포 내에서 핵과 세포질 모두에 널리 분포하며 DeSI-2는 세포질에서만 특이적으로 존재함을 확인하였다. DeSI-1이 BZEL 결합 단백질로 찾아졌고 또한 BZEL이 ubiquitination 과 sumoylation되는 단백질이므로 DeSI-1이 BZEL의 deubiquitination 또는 desumoylation을 조절할 수 있을지 확인하였다. 그 결과, DeSI-1을 과발현 해도 BZEL의 ubiquitin level은 변화하지 않았지만 DeSI-1이 과발현 되었을 때 BZEL의 sumoylation status는 현저히 감소함을 확인하였다. 또한 DeSI-1, BZEL, SUMO protein을 정제하여 in vitro desumoylation assay를 수행한 결과, DeSI-1이 sumoylated BZEL에 대해 deconjugation activity를 가짐을 확인하였다. DeSI-1의 기질 특이성을 확인하기 위해 SENP family의 기질로 알려진 PML과 ΔNp63에 대해 DeSI-1이 desumoylase activity를 가지는지 확인한 결과, DeSI-1은 PML과 ΔNp63를 desumoylation 시키지 못함을 확인함으로써 SENP family와는 다른 기질을 가지는 desumoylase임을 확인하였다. 포유동물에서는 desumoylase로 작용하는 단백질이 SENP family만 보고되어 있었으므로 이 논문의 결과는 새로운 class의 desumoylase가 존재함을 규명하였다.