Leptin Modulates the Response to Tamoxifen Treatment in ER-positive Breast Cancer Cell Lines

Abstract

여성의 비만과 유방암은 현대 사회에서 계속 증가하고 있으며, 비만은 특히 폐경후 여성에서 유방암의 위험인자로 잘 알려져 있다는 점에서 주목할 만하다. 렙틴은 지방세포에서 분비되는 강력한 아디포카인이며 렙틴신호는 유방암의 발달과 침윤에 있어서 중요한 역할을 한다. 렙틴은 렙틴 수용체에 결합하여 신호를 전달하며 또한 렙틴수용체는 에스트로젠수용체와의 상호작용을 통하여 체내의 에스트로젠 합성과 아로마타아제의 표현을 증가시키다고 알려져 있다. 따라서 호르몬 수용체 양성유방암 중 25%를 차지하는 호르몬 저항성의 원인으로 렙틴의 역할에 주목하였으며, 연구의 목적은 렙틴이 에스트로젠 수용체 양성 유방암 세포주에서 타목시펜 치료에 대한 반응에 어떤 영향을 미치는지 알아보고자 하였다. 에스트로젠 수용체 양성 유방암 세포주에서 타목시펜치료에 대한 렙틴의 영항을 알아보기 위하여 먼저 본 연구에서는 다양한 유방암 세포주에서 웨스턴블럿 어세이를 이용하여 렙틴과 렙틴수용체 단백 발현을 분석하였다. 다른 농도의 에스트로젠 조건에서 렙틴과 타목시펜을 투여하였을 때의 세포증식을 측정하여 렙틴의 작용에 대한 에스트로젠 농도의 영항도 분석하였으며, 또한 에스트로젠 수용체 양성 유방암세포에서 렙틴이타목시펜의 치료에 어떤 영향을 주는지 에스트로젠, 렙틴, 그리고 타목시펜을 병합치료하여 각각의 효과를 비교 분석하였으며, 이에 대한 세포신호전달의 변화를 확인하기위해 각 치료후 5분과 10분, 1시간, 6시간에 MCF-7 세포와 T-47D세포에서 total ERK1/2, phospho-ERK1/2, total STAT3, 그리고 phospho- STAT3의 활성화를 알아보았다. 웨스턴 분석에서 렙틴발현은 MCF-7, T-47D, HCC-70, MDA-MB453 세포에서 관찰되었고, 즉 에스트로젠 수용체 양성 세포에서 주로 강한 발현을 보였다. 렙틴수용체중 활성형 (Ob-Rb)의 발현은 MCF-7, SK-BR3, MDA-MB453, MDA-MB231에서 확인 되었으며 이는 비활성형 수용체 (Ob-Ra)에 비해 유방암세포에서 정상세포보다 발현이 증가되는 경향을 보였다. 에스트로젠 수용체 양성이며 렙틴과 렙틴수용체를 모두 발현하는 유방암 세포주인 MCF-7은 에스트로젠과 렙틴을 각각 단독 투여 하였을 때는 아무것도 투여하지 않은 대조군에 비해 유의한 증식효과 (p < 0.001)를 보였으며 타목시펜을 단독 투여하였을 때도 유의하게 대조군에 비해 억제 효과를 나타냈다 (p < 0.001). 하지만 MCF-7과 T-47D에서 에스트로젠만 투여 하였을 때와 비교하여 렙틴을 추가하였을 경우 렙틴 추가에 따른 부가적인 증식효과는 없었으며, 타목시펜의 경우도 렙틴을 추가하였을 때 타목시펜을 작용에 영향을 주지 않았다. 이에 비해 T47D 세포는 에스트로젠 수용체 양성, 렙틴양성이며 렙틴 수용체는 없는 유방암세포주로 에스트로젠을 투여하였을 때는 증식효과를 보였지만 렙틴은 증식효과를 나타내지 않았고 타목시펜의 억제효과는 유의하였다. T-47D에서도 에스트로젠이나 타목시펜에 렙틴을 병합하였을때에는 렙틴의 추가적인 호과는 나타나지 않았다. 즉 MCF-7이나 T-47D 세포에서 모두 렙틴은 에스트로젠이나 타목시펜의 단독치료시 그 효과에 영향을 주지않았다. 하지만 흥미롭게도, 에스트로젠 농도가 20 nM 일때 렙틴은 MCF-7과 T-47D 세포 모두에서 타목시펜 10 μM의 항에스트로젠 효과를 유의하게 억제하였으며, T-47D에서는 에스트로젠 농도가 10 nM일때도 같은 효과를 나타냈다. 이러한 효과는 렙틴수용체 양성인 MCF-7에서는 ERK1/2와 STAT3의 세포신호전달의 활성화를 통해 이루어짐을 확인하였으며, 렙틴수용체 음성인 T-47D에서는 ERK1/2과 STAT3가 활성화되지 않는 것을 확인하였다. 결론적으로 에스트로젠 수용체 양성 유방암 세포주인 MCF-7과 T-47D세포 에서 렙틴은 에스트로젠이 작용하는 조건하에서 타목시펜의 항에스트로젠 작용을 유의하게 억제하며 따라서 호르몬수용체 양성 유방암에서 렙틴의 작용을 억제시키면 호르몬 반응을 증강시킬 수 있다는 것을 의미하며, 따라서 렙틴의 억제는 호르몬 저항성을 극복할 수 있는 유망한 방법으로 생각된다.;Obesity is known as a risk factor for breast cancer in postmenopausal women. Leptin is a potent adipokine which mainly produced by adipose tissue and leptin signaling plays a significant role in tumor development and invasion of breast cancer. Leptin binds the leptin receptor (Ob-R) that activates JAK/STAT and the ERK signaling pathways. And ERα and Ob-R have been found coexpressed in malignant mammary tissue and breast cancer cell lines. Therefore, it is also possible that both signaling systems are involved in a functional cross&#8208;talk contributing to tumor development. In recent study, leptin induced aromatase gene expression, elevating aromatase activity and increasing estrogen synthesis in MCF-7 cell. Leptin was also able to enhance estrogen receptor α (ERα)&#8211;dependent transcription by decreasing ERα ubiquitination and degradation. And this implies some important roles that leptin may play on hormone resistance of ER-positive breast cancer. The aims of this study is to evaluate whether leptin modulates the effect on tamoxifen treatment in estrogen receptor (ER)-positive breast cancer cell. At first, to assess the effect of leptin on tamoxifen treatment in ER-positive breast cancer cell, we examined leptin and Ob-R expression by western blot assay in various breast cancer cells and cell proliferation by cell viability assay in combination with leptin and tamoxifen under estradiol (E2) treatment. And we analyzed the effect of leptin on the response of tamoxifen treatment in ER-positive breast cancer cells and which result from activation of ERK1/2 and STAT3 signaling pathway in leptin treatment. Leptin expressions were noted in MCF-7, T-47D, HCC-70, MDA-MB453 cells and Ob-R expressions in MCF-7, SK-BR3, MDA-MB453, MDA-MB231 cells by western blot analysis. The single treatment of E2, leptin and tamoxifen had a significant effect on MCF-7 and T-47D cells comparing to control (p < 0.001). But, leptin had no additional effect on both E2-only treated and tamoxifen-only treated&#8208;breast cancer cells including both MCF-7 and T-47D cells. High dose leptin (100 ng/㎖) had the proliferative effect on MCF-7 comparing to control (p < 0.001). But leptin, even in high dose, had no proliferative effect on T-47D cells. Leptin had an inhibitory effect on tamoxifen especially in high E2 (20 nM) setting in both MCF-7 and T-47D cells. We examined the effects of different treatment conditions on the activation of different Ob-R signaling pathway in MCF-7 and T-47D cells. The total- and phospho- ERK1/2 were detectable in MCF-7 cell at 5 minutes, were maximal at 1 hour and then reduced at 6 hours. Tamoxifen prominently inhibited the total- and phospho-ERK1/2 maximal at 6 hours. Interestingly, when leptin was added to combination treatment of E2 and tamoxifen, the total- and phospho- of ERK1/2 was more activated than combination without leptin at 1 hour in MCF-7. The total-STAT3 was also maximal at 1 hour. Tamoxifen relatively reduced the activation of total- and phospho-STAT3 at 6 hours in MCF-7 cell. When added leptin to combination of E2 and tamoxifen, activation of total- and phospho-STAT3 were relatively remarkable at 1 hour comparing to combination without leptin. In T-47D cell, the total- and phospho-ERK1/2 were also detectable at 5 minutes, maximal at 1 hour and then declined at 6 hours. Tamoxifen definitely inhibited total- and phospho-ERK1/2 maximal at 6 hours. When leptin was added to combination of E2 and tamoxifen, leptin relatively induced the activation of total ERK1/2 compared to combination of E2 and tamoxifen without leptin. But this result was not shown in phospho-ERK1/2 signaling. In STAT3 signaling, which is similar to ERK1/2, tamoxifen significantly inhibited total- and phospho-STAT3 at 6 hours. Interestingly, when lepin was added to the combination of E2 and tamoxifen, the activation of total STAT3 was prominent compared to the combination without leptin at 1 hour but this result not shown in phospho-STAT3 signaling in T-47D cell. We concluded that leptin interfere with the anti-estrogenic effects of tamoxifen under E2 condition both in MCF-7 and in T-47D ER-positive breast cancer cells through activation not only of Ob-R but also of crosstalk with other signaling systems. These results imply that inhibition of leptin is expected to enhance the hormone response in ER-positive breast cancer, and therefore, suggests a promising way to overcome hormonal resistance.