Modulation of Endothelial Function by Lipid Metabolites

Abstract

Although lipids are an important constituent of all cell membranes, excess accumulation of lipids and their metabolites leads to the development of various metabolic disorders. Vascular disease is the most common cause of mortality from metabolic disorders, and a common feature of all vascular diseases is endothelial dysfunction, which may be reversible, suggesting the potential of therapeutic targets to improve endothelial function specifically. Therefore, unraveling the mechanisms involved in endothelial dysfunction caused by lipid metabolites is important for understanding the development and treatment of vascular complications. For decades, studies of lipotoxicity-induced vascular damage focused on the role of low-density lipoprotein. More recently, it has become clear that sphingolipids such as ceramide are an emerging class of lipid mediators of the onset and progression of vascular damage. Therefore, the first half of this thesis addresses the mechanism of endothelial dysfunction by lysophosphatidylcholine (LPC), a major component of oxidized low-density lipoprotein, and the second half addresses the mechanism by one kind of ceramide-globotriaosylceramide (Gb3). High concentrations of LPC generate superoxide, resulting in the induction of NADPH oxidase and inhibition of superoxide dismutase 1. The effects on these oxidant and antioxidant enzymes further induce superoxide generation. Excess superoxide directly scavenges nitric oxide (NO) via conversion to peroxynitrite or indirectly reduces NO by extracellular signal-regulated kinase (ERK)-mediated downregulation of endothelial NO synthase (eNOS). Superoxide also activates redox-sensitive transcription factor NF-κB, which can lead to caspase-3 dependent apoptosis. Impaired NO release also activates caspase-3 and induces apoptosis. In brief, high concentrations of LPC induce eNOS downregulation and caspase-3-dependent apoptosis by superoxide overproduction in human endothelial cells and finally lead to endothelial dysfunction. However, low concentrations of LPC activate the Ca2+-permeable nonselective cation (NSC) current via Ca2+ release from intracellular stores such as the endoplasmic reticulum (ER). This results in Ca2+ influx through the plasma membrane (store-operated Ca2+ entry), and increased intracellular Ca2+ enhances eNOS protein levels. Therefore, Ca2+ influx through NSC channels might protect endothelial cells by producing NO and this may be a mechanism to protect human endothelial cells against LPC-induced cytotoxicity. Excessive endothelial Gb3 accumulation is associated with endothelial dysfunction and impaired endothelium-dependent relaxation in Fabry disease. In endothelial cells, the KCa3.1 channel contributes to endothelium-dependent relaxation. The animal model of Fabry disease studied here, α-galactosidase A (Gla) knockout mice, displayed age-dependent KCa3.1 channel dysfunction. KCa3.1 current and channel expression were significantly reduced in mouse aortic endothelial cells (MAECs) of aged Gla knockout mice, but were unchanged in MAECs of wild-type and young Gla knockout mice. A concentration-dependent reduction in KCa3.1 current and channel expression was also observed in Gb3-treated MAECs. Gb3 accumulation reduced KCa3.1 channel expression by downregulating ERK and activator protein-1 and upregulating repressor element-1 silencing transcription factor, and channel activity by decreasing intracellular levels of phosphatidylinositol 3-phosphate. In addition, endothelium-dependent relaxation was significantly attenuated in Gb3-treated mouse aortic rings. Gb3 therefore evokes KCa3.1 channel dysfunction in vascular endothelial cells, which may contribute to vasculopathy in Fabry disease. This study provides new evidence concerning the effects of lipid metabolites, which are related to cell fate control and ion channel modulation, on vascular endothelial cells. The results of this study suggest that pharmacological modulation of eNOS expression via superoxide and Ca2+ control may be the key for treating endothelial damage and the KCa3.1 channel can be a therapeutic target for lipotoxicity-induced vascular dysfunction.;지질은 세포막을 구성하는 주요 성분이지만, 세포 내에 과도하게 축적되면 다양한 대사질환을 유발한다. 대사질환 환자의 사망률에 가장 큰 영향을 주는 합병증은 심혈관 및 뇌혈관 질환이며, 모든 혈관질환에서 공통적으로 나타나는 것이 혈관내피세포 기능이상(endothelial dysfunction)이다. 이러한 혈관내피세포 기능이상은 회복이 가능한 가역적 반응이라는 연구 보고를 통해, 혈관내피세포의 기능을 개선할 수 있는 치료표적(therapeutic target)이 존재할 가능성이 제시된 바 있다. 지질대사체에 의해 유발되는 혈관내피세포 기능이상과 관련된 기전을 밝히는 것은 혈관질환의 발병기전과 치료방법을 찾기 위해 선행되어야 할 필수적인 연구로서, 선행연구에서는 대부분 저밀도 지방단백질 (low-density lipoprotein; LDL)을 대상으로 연구를 수행하였지만 최근 세라마이드(ceramide)와 같은 스핑고지질(sphingolipid)도 새롭게 주목을 받고 있다. 따라서, 본 논문은 죽상경화증(atherosclerosis)의 발병기전에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 산화성 저밀도 지방단백질(oxidized LDL)의 주요 구성성분인 lysophosphatidylcholine(LPC)에 의한 혈관내피 손상 기전과 세라마이드(ceramide)의 한 종류인 globotriasosylceramide(Gb3)에 의한 혈관내피 손상 기전을 알아보고자 하였다. 고농도의 LPC에 의해 생성된 superoxide는 NADPH oxidase를 활성화하고 superoxide dismutase 1을 억제하였다. 이러한 산화.항산화 효소에 대한 영향을 통해 LPC는 더 많은 superoxide를 생성한다. 과도하게 생성된 superoxide는 NO와 직접 반응하여 peroxynitrite를 형성함으로써 NO를 감소시키지만, extracellular signal-regulated kinase (ERK)를 매개로 한 eNOS의 발현 감소를 통해 간접적으로 NO를 감소시키기도 하였다. 이와 같은 과정을 통해 NO가 감소하면 caspase-3가 활성화되어 세포사(apoptosis)가 유발되었고, superoxide 자체가 산화환원 감수성 전사인자인 NF-?B를 활성화시켜 caspase-3를 통해 세포사를 유발하기도 하였다. 즉, 고농도의 LPC는 혈관내피세포에서 superoxide를 다량으로 생산하여 eNOS의 발현을 감소시키고 caspase-3의 활성화를 통한 세포사를 유발하여 결국 혈관내피세포 기능이상을 초래한다. 이와 달리, 저농도의 LPC는 소포체와 같은 세포 내 저장고에서 Ca2+을 분비시켜 nonselective cation (NSC) 전류를 증가시켰다. 즉, 세포막을 통해 Ca2+ 유입을 더욱 증가시켰으며 (store-operated Ca2+ entry), 이렇게 증가된 Ca2+은 eNOS의 발현을 증가시켰다. 그러므로 NSC 이온통로를 통한 Ca2+ 유입은 NO를 생성함으로써 혈관내피세포를 보호하게 되고, 이것은 혈관내피세포에서 LPC에 의한 세포독성을 막는 하나의 기전이 될 수 있을 것이다. 과도한 Gb3 축적은 Fabry 질환에서 혈관내피세포 기능 이상을 일으키며, 혈관내피세포 의존성 이완 작용을 방해하는 것으로 알려져 있다. 또한 혈관내피세포에서는 KCa3.1 이온통로가 혈관내피세포 의존성 이완과 관련 있는 것으로도 알려져 있다. Fabry 질환의 동물모델인 α-galactosidase A (Gla) 유전자결핍 생쥐(knockout mouse)를 이용한 실험을 통해, 연령이 많을수록 KCa3.1 이온통로 기능이상이 나타남을 확인하였다. KCa3.1 전류와 이온통로 발현이 나이든 Gla 유전자결핍 생쥐에서 분리한 혈관내피세포에서는 현저히 감소하였고, 정상(wild-type)과 어린 Gla 유전자결핍 생쥐에서는 차이가 없었다. 또한, Gb3를 처리한 혈관내피세포에서는 Gb3의 농도가 높을수록 KCa3.1의 전류와 이온통로 발현이 감소하였다. Gb3 축적은 ERK와 AP-1의 발현 감소, repressor element-1 silencing transcription factor의 발현 증가를 통해 KCa3.1 이온통로 발현을 감소시켰고, 세포내 phosphatidylinositol 3-phosphate 농도를 감소시켜서 KCa3.1 이온통로의 활성도를 감소시켰다. 또한, Gb3를 처리한 대동맥 고리(aortic rings)에서 혈관내피세포 의존성 이완이 크게 감소하였다. 즉, Gb3는 혈관내피세포에서 KCa3.1 기능이상을 일으키고, 이에 따라 Fabry 질환에서 혈관병증(vasculopathy)이 유발된다. 본 연구에서는 세포생사 조절과 이온통로 조절에 중점을 두어 지질대사체가 혈관내피세포에 미치는 영향을 알아보았다. 그 결과 superoxide와 Ca2+ 조절을 통한 eNOS 발현의 통제가 혈관내피세포 손상 치료의 한 방법이 될 수 있고, KCa3.1 이온통로가 지질독성에 의한 혈관기능 손상의 치료표적이 될 수 있다는 새로운 근거를 제시하였다