한국인 대장 종양에서 MicroRNA-21의 발현과 TIMP-3 및 PTEN의 MicroRNA-21의 표적인자로서의 가능성에 대한 연구

Abstract

마이크로 RNA(microRNA, 이하 miRNA)는 22개 내외의 뉴클레오티드로 이루어져 있는 작은 비 번역 RNA로, 상보적인 결합을 하는 특정 전령 RNA(messenger RNA, 이하 mRNA)에 결합하여 그 유전자의 발현을 유전암호해독(translation) 과정에서 조절한다. miRNA 중 하나인 miR-21은 암세포의 증식, 자멸(apoptosis), 이동에 관한 연구에서 종양유전자로 추정되고 있지만, 그 기전에 대해서는 잘 알려지지 않다. miRNA가 상보적인 염기서열을 가진 표적 유전자에 작용한다는 사실에 근거하여, 전산 분석을 통해 해당 miRNA의 표적을 유추할 수 있는데, TIMP-3와 PTEN은 miR-21와 부분상보결합이 가능한 염기서열을 가지고 있다. TIMP-3 단백 발현의 증가는 대장암의 종양 발생 및 침습에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는데, 최근 한 연구에서는 miR-21가 TIMP-3를 포함한 MMP 조절 자에 작용하여 신경아 교종과 담 관 암의 침습을 조절한다고 보고되었다. PTEN 역시 간암세포 주에서 miR-21의 발현에 따라 반비례적인 발현 양상을 보인다고 보고되었지만, 대장 종양 세포 주에서의 miR-21과 PTEN의 관계는 보고된 바가 없으며, 세포가 아닌 종양 조직에서의 miR-21의 발현과의 관계에 대해서도 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 용 종 절제 술과 수술적 절제를 통해 얻은 대장 용 종과 대장암 조직을 이용하여 임상양상에 따른 miR-21의 발현 변화를 조사하고, miR-21의 분자생물학적 표적으로 추측되는 TIMP-3와 PTEN이 대장 종양 조직 내에서 증명되는지 확인하고자 하였다. 또한 miR-21 발현이 감소함에 따라 TIMP-3와 PTEN의 단백 발현이 변화하는지 조사함으로써 miR-21과 TIMP-3 및 PTEN과의 관계를 증명하고자 하였다. 이화여자대학교 목동병원에서 용 종 절제술과 수술적 절제술을 시행한 대장선종 6예, 대장암 47예에서 miR-21의 발현을 실시간 중합효소연쇄반응으로 측정하여 종양 조직 대 정상 조직의 miR-21 발현 비율을 측정하였고, miR-21의 발현 비와 종양의 임상병리학적 특징과의 연관성을 비교하였다. 그리고, 연구 대상 조직의 일부에서 TIMP-3와 PTEN의 mRNA 발현은 반 정량 역 전사 중합효소 연쇄반응으로, 단백 발현은 Western blot을 이용하여 측정하였다. 또한, 인체 대장암 세포 주 HCT 116에 miR-21 안 티 센스 올리고 핵산 염을 전달(transfection)하여 miR-21의 감소에 따른 TIMP-3와 PTEN의 mRNA 및 단백 발현을 확인하였다. 총 53예의 대장 종양과 주변의 정상 조직에서 miR-21의 발현을 측정하였는데, 대장 종양 조직이 주변 정상 조직에 비해 통계적으로 유의하게 miR-21의 발현이 높았다(p<0.05). 또한 53예 중 38예(71.7%)에서 miR-21은 대장 종양 조직이 정상 조직보다 높은 miR-21의 발현을 보였고, 임상적 특징을 분석해 보았을 때 여성, 원 위부 종양, 림프절 침범이 있는 대장 종양에서 miR-21이 높은 발현을 보였다(p<0.05). 연령, 종양의 크기, 5 mg/dL 이상의 CEA의 발현, AJCC 병기, 조직학적 분화도, 림프관과 혈관의 침범은 miR-21의 발현과 통계적으로 유의한 연관성을 보이지 않았다. 다변 량 분석에서는 miR-21이 여성에서 통계적으로 유의한 발현의 증가를 보였다(p<0.05). 대장 종양 조직에서 TIMP-3 및 PTEN 단백 발현은 정상 조직보다 의미 있게 감소되어(p<0.05), TIMP-3 및 PTEN의 단백질로의 유전암호해독이 감소되었음을 알 수 있었다. TIMP-3와 PTEN의 mRNA와 단백 발현을 모두 측정할 수 있었던 15예의 대장 종양 조직에서, TIMP-3 및 PTEN의 mRNA 및 단백 발현은 miR-21의 발현과 의미 있는 연관성을 보이지 않았다(p>0.05). 그러나, 대장암 세포 주 HCT116에서는 miR-21 안 티 센스 올리고 핵산 염을 통해 miR-21의 발현을 저하시켰을 때, TIMP-3 및 PTEN의 단백 발현 증가를 확인할 수 있었다. 본 연구결과 miR-21은 대장 종양이 정상 조직보다 높은 발현을 보이며, 여성과 림프절 침범이 있는 대장 종양에서 높게 발현됨을 알 수 있었다. 또한 TIMP-3 및 PTEN은 대장 종양 조직에서는 miR-21의 발현과 연관성을 보이지 않았으나, 대장암 세포 주에서는 miR-21의 발현에 따라 단백 발현이 조절됨을 확인할 수 있었다.;Purpose: MicroRNAs (miRNA) are a class of small noncoding RNAs with important posttranscriptional regulatory functions. Recent data suggest that miRNAs are aberrantly expressed in many human cancers and that they may play significant roles in carcinogenesis. Substantial data indicate that microRNA-21 (miR-21) is significantly elevated in colorectal tumor. Although role for aberrant miRNA expression in cancer has been postulated, the pathophysiologic role and relevance of aberrantly expressed miRNA to tumor biology has not been established. The aims of this study were to define the expression of miR-21 in colorectal tumors and its associated clinicopathologic characteristics and to define the molecular biological targets of miR-21. Method: Expression of miR-21 in human colorectal tumor was evaluated as mean fold changes of miR-21 in tumor tissue compared to normal adjacent tissue(NAT) by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (real-time RT-PCR), and associations of miR-21 expression with clinicopathologic findings of tumor. Target gene and biologically functional effect of an up-regulated miR-21 were defined. Because tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (TIMP-3) and phosphatase and tensin homolog (PTEN) has partial complementary sequence to miR-21, tissue levels of TIMP-3 and PTEN were examined by semiquantitative RT-PCR and western blot in matched colorectal tumors and NAT, and in human colorectal cancer cell lines, HCT 116, before and after anti-miR-21 transfection. Result: In 53 pairs of colorectal tumor and NAT, miR-21 was significantly overexpressed in colorectal tumors using a quantitative real-time PCR (p<0.05). In female sex, distal colorectal tumor and node involved clorectal cancer, a significant association of elevated miR-21 level was observed (p<0.05). In multiple linear regression, women expressed higher levels of miR-21 than man(p<0.05). TIMP-3 and PTEN had no significance with miR-21 levels in human colorectal tumor tissue. However, knockdown of miR-21 showed increased TIMP-3 and PTEN protein expression compared to control in human colorectal cancer cell. Conclusion: miR-21 was significantly overexpressed in colorectal tumors and its level was affected by sex and nodal involvement. TIMP-3 and PTEN are regulated by miR-21 in human colorectal cancer cell line, but TIMP-3 and PTEN level showed no correlation with that of miR-21 in colorectal tumor tissue.