Effects of antidepressants on the activity of the rat glutamate transporter EAAT3 expressed in Xenopus oocytes

Abstract

최근의 연구들에 의하면 중추신경계의 흥분성 아미노산인 glutamate는 주요 우울증의 병태생리와 항우울제의 치료 효과에 관여하는 것으로 보인다. 이에 본 연구에서는 세 가지 항우울제, 즉 삼환계 항우울제인 doxepin, imipramine과 선택적 serotonin 재흡수 억제제인 fluoxetine를 이용하여 뇌에서 세포외 glutamate의 농도를 조절하는 excitatory amino acid transporter type 3 (EAAT3)의 활성도에 항우울제가 어떤 영향을 나타내는지 알아보고자 하였다. Xenopus oocyte에 EAAT3를 발현시킨 뒤, 다양한 농도의 항우울제의 존재 하에 L-glutamate (30 μм)를 적용시키고 two-electrode voltage clamp를 이용하여 막전위를 측정하였다. 항우울제의 농도는 doxepin 0.063-1.58 μм, imipramine 0.063-0.95 μм, fluoxetine 0.087-2.31 μм로 하였다. 또한 EAAT3 활성도의 변화에 protein kinase C (PKC)가 관여하는지 알아보기 위하여 PKC 활성물질인 phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA) (100 nM)에 oocytes를 10분간 처치한 후 0.32 μм imipramine과 0.79 μм doxepin을 적용하고 막전위를 측정하였다. Doxepin은 0.063-1.58 μм의 농도에서 EAAT3 활성도를 통계적으로 유의하게 감소시켰고, imipramine은 0.16-0.95 μм의 농도에서 농도 의존적으로 EAAT3 활성도를 감소시켰다. 그러나 0.087-2.31 μм의 fluoxetine은 EAAT3 활성도를 통계적으로 유의하게 변화시키지 못했다. PMA는 EAAT3 활성도를 증가시켰으며, 0.32 μм의 imipramine은 PMA 존재여부와 상관없이 EAAT3 활성도를 유사한 정도로 감소시켰다. 그러나 0.79 μм의 doxepin은 PMA에 의한 EAAT3 활성화를 감소시키지 못했다. 결론적으로 이 연구를 통해 doxepin과 imipramine이 임상적으로 사용되는 농도에서 EAAT3 활성도를 감소시키며 fluoxetine은 그렇지 않음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 doxepin과 imipramine이 glutamate성 신경전달을 증가시키는 새로운 작용 부위를 시사하며, 이들의 항우울 효과에도 관여할 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서 사용한 농도에서 imipramine이 EAAT3에 작용하는 기전에 PKC가 관여하지 않는 것으로 보이나 doxepin의 경우에는 PKC가 관여하는 것으로 보인다.;Many preclinical and clinical researches suggest that the excitatory amino acid glutamate seems to be involved in the pathophysiology of major depressive disorders and in the antidepressant-mediated therapeutic effects. We investigated the effects of antidepressants, doxepin, imipramine, which are tricyclic antidepressants, and fluoxetine, a selective serotonin reuptake inhibitor, on the activity of excitatory amino acid transporter type 3 (EAAT3), proteins that can regulate extracellular glutamate concentrations in the brain. EAAT3 was expressed in the Xenopus oocytes. Using a two-electrode voltage clamp, membrane currents were recorded after application of L-glutamate (30 μм}) in the presence or absence of various concentrations of doxepin (0.063-1.58μм}), imipramine (0.063-0.95 μм}), and fluoxetine (0.087-2.31μм}). To study the effects of protein kinase C (PKC) activation on change of EAAT3 activity, oocytes were pre-incubated with 100 nM phorbol 12-myristate-13-acetate (PMA), a PKC activator, for 10 min just before the applications of 0.32 μм} imipramine and 0.79 μм} doxepin. Doxepin significantly decreased EAAT3 activity at 0.063-1.58 μм}. Imipramine concentration-dependently reduced EAAT3 activity. This inhibition was statistically significant at 0.16-0.95 μм}. However, fluoxetine did not affect EAAT3 activity at 0.087-2.31 μм} significantly. PMA increased EAAT3 activity. Imipramine of 0.32 μм} induced a similar degree of decrease in EAAT3 activity in the presence or absence of PMA. However, 0.79 μм} doxepin did not abolish the enhancement of EAAT3 activity by PMA. In summary, we have shown that doxepin and imipramine, but not fluoxetine, inhibit EAAT3 activity at clinically relevant concentrations. This result represents a novel site of action for doxepin and imipramine to increase the glutamatergic neurotransmission and may contribute to their antidepressant effect. PKC may not have been involved in the effect of imipramine on EAAT3 but do in that of doxepin at the concentrations we studied.