Association of vascular access failure with microparticles in hemodialysis patients and Effects of p38 inhibition on microparticle production in vitro

Abstract

Background/Purpose: Vascular access failure, a major cause of morbidity in hemodialysis (HD) patients occurs mainly at stenotic endothelium following an acute thrombotic event. Microparticles (MPs) are fragments derived from the cell membrane by cellular activation or apoptosis in response to various stimuli and are closely associated with coagulation, thrombotic propensity, vascular dysfunction, and inflammatory responses. We investigated the relationship between levels of circulating MPs and vascular access patency or inflammatory markers in HD patients. We also examined whether antiproliferative drugs could inhibit the generation of endothelial MPs (EMPs) induced by uremic toxin in vitro, as well as the involvement of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) in EMP generation. Methods: Eighty two clinically stable HD patients were enrolled. We used flow cytometry to measure: 1) EMPs identified by CD31+CD42- or CD51+; 2) platelet MPs (PMPs) identified by CD31+CD42+ in plasma samples of each patient. Vascular access patency was defined as the interval from the time of access formation to the time of first vascular stenosis in each patient. Twenty eight healthy individuals were enrolled in the control group. In parallel, CD31+CD42-EMP counts were measured in supernatants of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) incubated with indoxyl sulfate, and the EMP responses to drugs which were shown to have antiproliferative effects (losartan, lovastatin, clopidogrel, and mesoglycan) were examined. We then measured the effects of MAPK inhibitors on CD31+CD42-EMPs in HUVEC supernatants. Results: 1) The levels of EMP (both CD31+CD42- and CD51+) and PMP were significantly higher in HD patients than in healthy subjects. Theses findings were maintained in analysis with excluding diabetic patients. In age-matched subgroup analysis, CD31+CD42-EMPs and CD31+CD42+PMPs were increased significantly in the plasma of HD patients compared to healthy controls. 2) In non-diabetic patients, CD31+CD42-EMPs and CD31+CD42+PMPs were more elevated in the shorter vascular access survival group than in the longer survival group. 3) In vitro, indoxyl sulfate significantly induced the release of EMPs in a dose dependent manner in HUVECs. 4) Losartan, lovastatin, clopidogrel and mesoglycan with 10-50 μM concentrations of each drug inhibited EMP generation induced by indoxyl sulfate, with clopidogrel the most effective. 5) The p38 MAPK inhibitor (SB-203580, 20 μM) effectively suppressed EMP generation induced by indoxyl sulfate in HUVECs. 6) Clopidogrel suppressed MAPK signaling pathways; p38 MAPK, ERK1/2, and JNK activated by indoxyl sulfate in HUVECs. Among them, the p38 MAPK was most effectively suppressed. Conclusions: Elevated circulating EMP or PMP counts are influenced by uremia per se and increased levels of MP (EMP and PMP) may be associated with vascular access stenosis in HD patients. EMP analysis may open a new door to estimate thrombotic propensity in HD patients. In vitro, clopidogrel, lovastatin, losartan, and mesoglycan inhibited EMP generation induced by indoxyl sulfate in HUVECs. The p38 MAPK signaling involved EMP generation and was inhibited by clopidogrel. Further studies will be necessary to define the mechanism of MP generation and the therapeutic benefit of these drugs for prevention of vascular access stenosis.;연구배경 및 목적: 혈관 통로의 기능부전은 혈액투석 환자에서 이환율의 중요한 원인으로 알려져 있다. 혈관 통로의 기능부전이 발생하는 기전은 혈관 내피세포의 손상에 따른 혈관 평활근세포의 증식으로 신생혈관내막 과다형성이 유발되고, 이로 인한 혈관 내 협착과 연이은 급성 혈전의 형성으로 알려져 있다. 죽상경화의 치료 약물들을 응용하여 신생혈관내막 과다형성을 치료하기 위한 노력들이 있었으나, 아직 효과가 확실한 예방이나 치료 방법은 없는 상태이다. 세포미세입자 (MP, microparticle)는 다양한 자극에 의한 세포의 활성화 또는 자멸 과정 중에 세포막으로부터 형성되어 떨어져 나오는 세포막의 파편으로, 정상적으로는 혈액 응고 과정에 관여하지만, 과다하게 생성될 경우 혈전을 형성하는 경향 (thrombotic propensity), 혈관 기능부전, 염증 반응과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다. 많은 연구에도 불구하고, MP의 형성 기전이나 질병에 미치는 영향은 아직 불분명한 상태이다. 본 연구에서는 혈액투석 환자에서 혈장 내의 MP 농도와 혈관 통로기능 부전과의 관계를 알아보고, 생체 밖에서 요독 물질에 의해 유도된 혈관 내피세포 기원의 세포미세입자 (EMP, endothelial microparticle)가 동맥경화와 관련된 약물들에 의해 억제되는지를 보고자 하였다. 마지막으로, mitogen-activated protein kinase (MAPK) 활성화가 EMP 형성에 관여하는지 알아보고자 하였다. 실험방법: 임상적으로 안정 상태인 혈액투석 환자 82명과 특별한 병력이 없는28명의 건강한 대조군을 대상으로 단면 연구를 시행하였다. 대상자들의 혈액을 체취 하여, 유세포분석기를 이용하여 혈장 내의MP수를 측정하여 비교하였다. 형광물질이 부착된 유세포분석용 항체를 사용하여, EMP는 CD31+CD42- 또는 CD51+, 혈소판 기원의 미세입자 (platelet microparticle; PMP)는 CD31+CD42+ 인 입자들로 정의하였다. 혈관 통로 기능부전은 혈관 통로를 만든 후 가장 처음 혈관 협착이나 혈전 형성에 의해 혈관 통로를 사용할 수 없게 된 시점까지의 기간으로 정의하였다. 생체 밖의 실험으로는 인형 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells; HUVECs)에 요독 물질인indoxyl sulfate를 첨가하여 배양한 후, 원심분리하여 얻은 상청액에서 CD31+CD42-EMP를 측정하였다. 그 다음으로 losartan, lovastatin, clopidogrel, mesoglycan등의 약물과 indoxyl sulfate를 처리하여 배양한 HUVECs을 원심분리하여 얻은 상청액에서 EMP 수를 측정하여 비교하였다. 마지막으로 MAPK 억제제 (p38 MAPK 억제제, SB-203580; ERK 억제제, U0126; JNK억제제, SP600125) 와 indoxyl sulfate를 처리한 HUVECs의 상청액에서 EMP를 측정하였다. 결과: 1) 혈액투석 환자군에서 혈장 내의CD31+CD42-EMP, CD51+EMP, PMP 수치 모두 대조군에 비해 의미 있게 증가하였다. 비당뇨군 환자에서도 이러한 차이는 지속되었다. 나이를 고려한 분석에서, CD31+CD42-EMPs와 PMP가 혈액투석 환자군에서 증가하였다. 2) 비당뇨 환자군에서 CD31+CD42-EMP와 PMP모두 혈관 통로 기능부전까지의 기간이 짧은 환자들에서 의미 있게 증가하였다. 3) indoxyl sulfate는 농도에 비례하여 HUVECs에서 EMP 생성을 증가시켰다. 4) losartan, lovastatin, clopidogrel, mesoglycan 모두 10~50 μM 범위의 농도에서, indoxyl sulfate에 의해 유도된 EMP 생성을 의미 있게 억제시켰다. 그 중에서 clopidogrel이 가장 효과적으로 EMP생성을 억제하였다. 5) p38 MAPK 억제제 (SB-203580, 20 μM)는 HUVECs에서 indoxyl sulfate에 의해 유도된 EMP 형성을 가장 효과적으로 억제하였다. 6) indoxyl sulfate는 HUVECs에서 p38, ERK1/2, JNK MAPK경로 모두를 활성화시켰고, 이는 clopidogrel (20 μM)에 의해 억제되었다. 그 중에서 활성화 된 p38 MAPK 경로가 가장 효과적으로 억제되었다. 결론: 혈액투석 환자에서 혈액 내의 EMP 생성은 요독 그 자체에 의해 증가될 수 있고, EMP나 PMP의 증가는 혈관 통로 기능부전과 관련이 있다. 따라서, 혈액투석 환자에서 EMP나 PMP를 측정하는 것은 혈관 통로 기능부전을 예측하는 간단하고 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 기대한다. 요독 물질에 의해 증가된EMP 생성은 clopidogrel 과 p38 억제제에 의해 효과적으로 억제되었고, 이는 p38 MAPK 경로의 활성화와 연관이 있었다. 추 후 본 연구의 생체 밖 실험에서 사용된 약물들이 생체 내에서 혈관 통로 기능부전 예방효과가 있는지를 검증하는 실험이 필요할 것으로 사료된다.