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Alterations in transthyretin gene expression and its transcriptional regulation in a mouse model of phenylketonuria

Title
Alterations in transthyretin gene expression and its transcriptional regulation in a mouse model of phenylketonuria
Other Titles
페닐케톤뇨증 쥐 모델에서의 transthyretin 유전자 발현 변화와 전사적 조절 연구
Authors
박주원
Issue Date
2009
Department/Major
대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
박혜영정성철
Abstract
Background: Phenylketonuria (PKU) is an autosomal recessive disorder caused by a deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), which catalyzes the conversion of phenylalanine to tyrosine. The resultant hyperphenylalaninemia causes light colored skin and fur, mental retardation, seizure, and abnormalities in behavior and movement. Gene expression profiles were analyzed in brain tissues of Pahenu2mice to elucidate the pathological changes involved in phenylalanine-induced neurological damage and to identify biochemical markers associated with neurological damage. Methods: Gene expression profiles in brain tissues of Pahenu2mice were analyzed by microarray analysis. The altered gene expression was confirmed by real-time PCR and Western blot analysis. To identify markers associated with neurological damage, transthyretin (TTR) expression was examined in serum by Western blot analysis. TTR expression was also examined in liver, since TTR is mainly synthesized in liver. TTR expression in HepG2 cells treated with phenylalanine and its metabolite, phenylpyruvic acid was analyzed. To identify transcriptional regulation of Ttr gene by phenylalanine and phenylpyruvic acid, luciferase analysis using reporter plasmids containing TTR promoter region was performed in HepG2 cells. Mitogen activated protein kinase (MAPK) activation was analyzed by Western blot analysis. Results: Gene expression profiling of brain tissue from a mouse model of PKU revealed overexpression of transthyretin (Ttr). In contrast to its over-expression in the brain, TTR was down-regulated in liver tissues and sera of PKU mice offered unrestricted access to a diet containing phenylalanine. Expression of TTR decreased in a time-dependent manner in phenylalanine-treated HepG2 cells. Treatment of HepG2 cells with 0.9 mM phenylalanine and 1.2 mM phenylpyruvic acid decreased transcription of the Ttr gene in a time-dependent manner and decreased the transcriptional activity of the TTR promoter site, which was partly mediated though HNF4??. Treatment with 0.9 mM phenylalanine or 1.2 mM phenylpyruvic acid diminished HNF4?? nuclear protein levels and activated the Jun NH2-terminal kinase/stress-activated kinase (JNK/SAPK) in HepG2 cells. In contrast, treatment with 0.9 mM phenylalanine or 1.2 mM phenylpyruvic acid induced ERK1/2 activation in PC-12 cells; ERK1/2 activation was also elevated in the brainstem of the PKU-affected mice. Conclusions: This study suggests that alteration of TTR expression can be involved in the pathogenesis of PKU. Phenylalanine and its metabolite, phenylpyruvic acid affected the MAPK activation in a cell- and tissue-specific manner. This may explain between-tissue differences in gene expression, including Ttr gene expression, in the PKU mouse model.;연구배경: 페닐케톤뇨증 (PKU)은 상동염색체 열성 유전병으로 페닐알라닌 (Phenylalanine)을 타이로신 (Tyrosine)으로 변환하는 페닐알라닌 수산화효소 (Phenylalanine hydroxylase)의 결핍으로 인해 생긴다. 과다하게 축적된 페닐알라닌은 연한 담갈색 피부와 모발, 지능 장애, 경련 등의 신경행동학적 이상을 야기한다. 본 연구에서는 페닐알라닌이 신경손상을 일으키는 병리 현상을 밝히고 신경손상과 관련된 생화학적 지표를 찾고자 페닐케톤뇨증 쥐 모델 (BTBR-Pahenu2)의 뇌 유전자 발현을 분석하였다. 실험방법: 마이크로어레이 (Microarray) 실험방법을 이용하여 페닐케톤뇨증 쥐 모델의 뇌 유전자 발현 변화를 분석하였고, 변화된 유전자 발현은 실시간 PCR (Real-time PCR)과 웨스턴 블로팅법 (Western blot)으로 확인하였다. 신경학적 손상과 관련된 지표를 찾기 위해 웨스턴 블로팅법을 이용하여 쥐 혈청에서 transthyretin (TTR)의 발현을 확인하였고, 또한 TTR이 주로 간에서 합성되기 때문에, 간에서의 TTR 발현을 확인하였다. 페닐알라닌과 페닐알라닌 대사체인 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)을 처리한 HepG2 세포에서 TTR의 발현 변화를 살펴본 후, Ttr 유전자의 전사적 조절을 확인하기 위해 TTR promoter 부위가 삽입된 리포터 플라스미드 (Reporter plasmid)를 사용하여 루시퍼라아제 실험(Luciferase assay)을 시행하였다. Mitogen activated protein kinase (MAPK) 활성 역시 웨스턴 블로팅법을 이용해 확인하였다. 실험결과: 페닐케톤뇨증 쥐 모델의 뇌 유전자 발현을 분석한 결과 transthyretin (Ttr)의 발현이 증가되어 있었다. TTR이 페닐케톤뇨증 쥐 뇌에서의 발현이 증가한 것에 반해, 페닐알라닌 제한 식이를 시행하지 않았음에도 불구하고 페닐케톤뇨증 쥐의 간 조직과 혈청에서의 TTR발현은 감소하였다. HepG2 세포에 페닐알라닌을 처리하자 TTR의 발현이 시간 비례적으로 감소하였다. 마찬가지로, 0.9 mM 페닐알라닌과 1.2 mM 페닐피루브산을 처리한 HepG2 세포에서 Ttr 유전자의 전사가 감소하였으며, TTR promoter 부위의 전사 활성도가 떨어졌는데, 이는 부분적으로 HNF4α에 의해 매개됐다. 페닐알라닌과 페닐피루브산을 HepG2 세포에 처리하자 핵 단백질 HNF4α는 감소하였으며 Jun NH2-terminal kinase/stress-activated kinase (JNK/SAPK)의 활성이 증가하였다. 이와 반대로, 0.9 mM 페닐알라닌과 1.2 mM 페닐피루브산을 PC-12 세포에 처리하자 extracellular signal regulated kinase 1/2 (ERK1/2)의 활성이 증가되었으며, 페닐케톤뇨증 쥐 뇌간 (Brain stem)에서의 ERK1/2의 활성 역시 증가되어 있었다. 결론: 본 연구는 페닐케톤뇨증(PKU)의 병리기전에 TTR 발현 변화가 관련되어 있음을 암시하며, 페닐알라닌과 페닐알라닌 대사체인 페닐피루브산이 조직 특이적으로 MAPK 활성에 영향을 미친다는 것을 밝혀냈다. 이러한 조직 특이적 MAPK 활성은 페닐케톤뇨증 쥐 모델에서 Ttr 유전자 발현을 포함한 여러 유전자들이 조직 특이적으로 발현하는 것에 기여할 것으로 생각된다.
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일반대학원 > 의학과 > Theses_Ph.D
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