Suppression of inducible nitric oxide synthase by pre-treatment and post-treatment of vitamin C in fibroblast

Abstract

배 경 일산화질소 (nitric oxide, NO)는 자유유리기로 생체에서 중요한 역할을 하며 세포의 종류에 따라 세포의 생존에 다양한 역할을 나타낼 수 있으며 창상치유에 관여하는 것으로 알려져 있다. NO는 nitric oxide synthase (NOS)에 의해 생성되며 특히, 손상이나 염증 등이 발생하였을 때에는 inducible NOS (iNOS)가 관여하게 된다. NO가 과다하게 생성되었을 경우에는 reactive oxygen species (ROS)와 reactive nitrogen species (RNS)가 과발현하여 조직의 손상을 가져올 수 있다고 알려져 있다. 비타민 C는 강력한 항산화제 및 항염제이며, 창상의 치유와 조직의 재생기능이 있는 것으로 알려져 있다. 대부분의 이러한 비타민 C의 기능에 관한 연구는 비타민 C 전처치를 통한 방식으로 연구되고 있으나, 실제 임상에서 접하게 되는 손상 환자는 비타민 C의 전처치가 없이 피부에 손상을 입는 경우가 더 많다. 목 적 비타민 C의 전치치와 후처치가 iNOS 과발현의 감소에 어떠한 효과가 있는지를 통해 향후 비타민 C가 피부의 손상을 줄이고 회복을 촉진시키는데 역할을 할 수 있을지 객관적으로 검증하고자 하였다. 재 료 및 방 법 인체 포피에서 채취한 섬유아세포를 배양하여 세포실험을 시행하였다. 피부손상과 관련되어 상처 치유의 지연과 조직 손상을 유발한다고 알려진 자외선 (200 mJ/㎠), Lipopolysaccharide (5 ㎍/㎖), TNF-α (100 U/ml)으로 처리하기 전과 후에 Vitamin C 500 μM로 6시간, 12시간, 24시간 동안 배양한 후 세포를 수확하였다. inducible nitric oxide synthase (iNOS)의 억제여부를 알아보기 위해 mRNA 수준에서 RT-PCR을 시행하였고, 단백질 수준에서 Western blot을 시행하였으며 t-test와 ANOVA test를 이용하여 각각의 대조군과 비교분석하였다. 결 과 자외선, LPS, TNF-α에 의해 증가하였던 섬유아세포의 iNOS 생산은 비타민 C를 전처치 시행 후 6시간, 12시간, 24시간이 경과한 시점에서 모두 유의하게 감소하였다. 또한, 비타민 C를 후처치한 경우에서도 6시간, 12시간, 24시간이 경과한 시점 모두에서 iNOS 생산이 유의하게 감소하였다. 결 론 비타민 C은 전처치 뿐만 아니라 후처치가 시행된 경우에서도 피부 섬유아세포에서 자외선, LPS, TNF-α에 의해 발생하는 iNOS를 효과적으로 억제하였다. 따라서, 손상과 감염, 염증 발생시 비타민 C의 투여가 효과적이며, 전처치가 되어 있지 않은 경우에 있어서도 이후 비타민 C를 투여한다면 iNOS의 과다 생성을 억제하는 효과를 기대할 수 있을 것이다.;The free radical nitric oxide (NO) has emerged as a fundamental signaling molecule for many biological processes. It maintains skin homeostasis and modify several skin reactions. NO is synthesized by nitric oxide synthase (NOS) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) is induced in response to various stimuli such as inflammation and injuries in contrast to the other NOS isoforms. NO can interact with reactive oxygen intermediates thereby generating the highly reactive nitrogen species. The increased production of NO contributes to oxidative and nitroxidative stress leading cell damages. Vitamin C is part of a system of antioxidants that protect the skin from oxidative stress and showed faster and greater beneficial effect on wound healing. Usual experiments concerning vitamin C are performed in the setting of vitamin C pre-treatment conditions. However, clinically, skin wounds can be accompanied by severe systemic inflammatory insults such as trauma, burns, or infections without any pre-treatment of vitamin C. We therefore evaluated the efficacy of vitamin C on iNOS expression in fibroblasts against ultraviolet (UV), lipopolysaccharides (LPS), and tumor necrosis factor-α (TNF-α) to test whether application of vitamin C immediately after wound healing would enhance recovery and protection against bacterial contamination. Normal human dermal fibroblasts were obtained from foreskin of healthy volunteer. some cells then were irradiated UVB (200 mJ/㎠) and treated LPS (5 μg/mL) and TNF-α (100 U/mL). Vitamin C respectively and incubated for 6, 12, and 24 hours. Production of iNOS mRNA was evaluated by RT-PCR and production of iNOS protein was evaluated by Western blot. iNOS levels between the untreated groups and pre-treatment or post-treatment of vitamin C groups were compared using the t-test and ANOVA test. Differences among groups were considered significant at p <0.05. Vitamin C post-treatment, as well as pre-treatment, decreased the expression of iNOS mRNA at 6 hours, 12 hours and 24 hours after stimulation with UV, LPS, and TNF-α when compared with untreated groups. Vitamin C post-treatment, as well as pre-treatment, decreased the expression of iNOS protein at 6 hours, 12 hours and 24 hours after stimulation with UV, LPS, and TNF-α when compared with untreated groups. We showed that vitamin C suppressed iNOS mRNA and protein levels after stimulation with UVB, a photooxidative stress, with TNF-α, an inflammatory mediator, and with LPS, a bacterial endotoxin. Our experiment suggest that vitamin C post-treatment would protect the skin by reducing the overproduction of iNOS in inflammatory and infected wound condition as well as pre-treatment in addition to the revealed roles of vitamin C protecting complicated wound from oxidative and nitroxidative stress by scavenging ROS and RNS. According to our results, vitamin C treatment may could be used for prevention and treatment in complicated wound healing.