Interactions of ion channels and transporters in endothelial cells

Abstract

Interactions between channels and transporters through changes in intracellular ionic concentration and its effect on endothelium-dependent relaxation (EDR) were investigated in mouse aorta and endothelial cells. When Na^(+)-K^(+) pump was activated by increasing extracellular K^(+) concentration ([K^(+)]_(0)) from 6 to 12 mM, EDR was inhibited in mouse aortic rings, and increment of [Ca^(2+)]_(i) was also inhibited in mouse aortic endothelial cell (MAEC). To investigate the mechanism involved in this ‘K^(+)-induced inhibition of EDR’, mouse aorta or MAEC was pretreated with Na^(+) ionophore monensin, and the effect of [K^(+)]_(0) increment was abolished, indicating that this effect is [Na^(+)]_(i) -dependent. This monensin-evoked EDR was reversed by Na^(+)/[Ca^(2+) exchanger (NCX) blocker KB-R7943. In MAEC, intracellular [Ca^(2+) concentration ([Ca^(2+)]_(i)) was increased when Na^(+) was loaded by monensin or extracellular Na^(+) was depleted, and this [Ca^(2+) increase was inhibited by KB-R7943, which implies that NCX is involved in this [Na^(+)]_(i) -dependent vasoconstriction. 2',4'-dichlorobenzamil or Ni^(2+), which blocks both mode of NCX, suppressed K^(+)-induced inhibition of EDR and [Ca^(2+)]_(i) increase. KB-R7943 did not suppress K^(+)-induced inhibition at up to 10 μM but did at 30 μM. Since KB-R7943 blocks reverse mode of NCX at low concentration, and both mode at high concentration, forward mode of NCX is involved in K^(+)-induced inhibition. In current-clamped perforated patch, depolarized membrane by increment of [K^(+)]_(0) from 6 to 12 mM was hyperpolarized by ouabain, Ni^(2+) or KB-R7943, indicating concomitant activation of Na^(+)-K^(+) pump and the forward mode of NCX by [K^(+)]_(0) increment. [K^(+)]_(0) is regulated by K^(+) channels, thus interaction of large-conductance Ca^(2+)-activated K^(+) (BK_(Ca)) channel with Na^(+)-K^(+) pump or NCX was investigated. In voltage-clamped whole cell, BK_(Ca) currents were significantly augmented by increasing [K^(+)]_(0) (Na^(+)-K^(+) pump activation) and reduced by decreasing [K^(+)]_(0) (Na^(+)-K^(+) pump inhibition). By Ni^(2+) or KB-R7943, [Na^(+)]_(i) was decreased while BK_(Ca) current was activated simultaneously, and BK_(Ca) currents were completely inhibited by monensin. These results suggest that an increase in [Na^(+)]_(i) inhibits BK_(Ca) channel. Since background Na^(+) influx determines [Na^(+)]_(i), its role on BK_(Ca) channel was investigated. First, existence of background Na^(+) influx on endothelial cell was confirmed by measuring membrane potential. Resting membrane potential of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) was -8.1 ± 1.2 mV and replacement of extracellular Na+ by NMDG+ or mannitol hyperpolarized cells ls to -55 mV. In contrast, replacement of Na^(+) by Li+ did not change membrane potential. In voltage-clamped HUVECs, hyperpolarizing the holding potential from 0 mV to negative potentials increased [Na^(+)]_(i) and vice versa. Thus, background Na^(+) influx and membrane potential affect each other, which in turn determine [Na^(+)]_(i). In voltage-clamped whole cells, BK_(Ca) currents were significantly increased by decreasing [Na+]_(o). This direct regulation by Na+ was further evaluated in singlechannel inside-out patches, when [K^(+)]_(i) was set to 140 mM, increasing [Na^(+)]_(i) reduced single channel conductance but not open probability (NPo). However, when [Na^(+)]_(i) was constant as 0 mM, both conductance and NPo were reduced by decreasing [K^(+)]i. Gradual increment of [Na^(+)]_(i) by replacing Na^(+) with K^(+) reduced both single channel conductance and NPo of BK_(Ca) channels. These results suggest that BK_(Ca), NCX, Na^(+)-K^(+) pump and background Na^(+) influx interact each other through [Na^(+)]_(i) and [K^(+)]i changes. These interactions may affect [Ca^(2+)]_(i) within endothelial cells, thereby regulating vascular constriction.;본 연구에서는 혈관 내피세포 내 이온 농도 변화에 따른 이온통로 및 운반체 간의 상호 작용과 이것이 내피 의존성 혈관이완에 미치는 영향에 대해 알아보았다. 세포 외 K^(+)을 6에서 12 mM로 높여 Na^(+)-K^(+) pump를 활성화시키면 mouse aortic ring을 이용한 수축실험에서 내피 의존성 혈관이완이 억제되었으며 mouse aortic endothelial cell (MAEC)에서도 세포 내 Ca^(2+) 증가가 억제되었다. 이러한 ‘K^(+)에 의한 내피 의존성 혈관이완 억제 효과’의 기전을 알아보기 위해 mouse aorta나 MAEC를 Na^(+) 이온 투과 담체인 monensin으로 전처치하여 세포 내 Na^(+)을 높이니 세포 외 K^(+) 증가 효과가 상쇄되어 이러한 과정에 세포 내 Na^(+)이 연관되었음을 알 수 있었다. Monensin에 의한 이러한 내피 의존성 혈관이완은 Na^(+)/Ca^(2+) exchanger (NCX) 억제제인 KB-R7943을 쓰면 사라졌다. MAEC에서도 monensin을 처리하거나, Na^(+)을 Li^(+)으로 치환하여 세포 외 Na^(+)을 없애면 세포 내 Ca^(2+)이 증가하였으며 이러한 증가는 KB-R7943에 의해 억제되었다. 이는 세포 내 Na^(+)과 연관된 혈관수축 기전에 NCX가 관여함을 시사하는 것이다. NCX의 두 가지 mode를 모두 억제하는 2',4'-dichlorobenzamil과 Ni^(2+)은 K^(+)에 의한 내피 의존성 혈관이완 억제 효과를 방해함으로써 결과적으로 내피 의존성 혈관이완을 증가시켰다. KB-R7943은 10 μM에서는 효과가 없었으나 30 μM에서는 K^(+)에 의한 억제 효과를 방해하였다. KB-R7943이 저농도에서는 NCX의 reverse mode를 억제하고, 고농도에서는 두 가지 mode를 모두 억제한다는 사실을 고려할 때, K^(+)에 의한 억제 효과에는 NCX의 forward mode가 관여함을 알 수 있다. 이는 막전압 측정을 통해서도 확인할 수 있었는데, Current-clamped perforated patch에서 세포 외 K^(+)을 6에서 12 mM로 증가시키면 세포막 전압은 저분극 되었으며 이는 ouabain이나Ni^(2+), KB-R7943에 의해 재분극 내지는 과분극 됨으로써 세포 외 K^(+) 농도를 높일 때 Na^(+)-K^(+) pump와 NCX의 forward mode가 동시에 관여함을 알 수 있었다. 세포 외 K^(+) 농도는 K^(+) 이온통로에 의해 결정되므로 large-conductance Ca^(2+)-activated K^(+) (BK_(Ca))와 Na^(+)-K^(+) pump, NCX 간의 상호 작용에 대해서 살펴보았다.BK_(Ca) current는 세포 외 K^(+)을 증가(Na^(+)-K^(+) pump의 활성화)시키면 커졌고, 세포 외 K^(+)을 감소(Na^(+)-K^(+) pump의 억제)시키면 작아졌다.Ni^(2+)과 KB-R7943는 세포 내 Na^(+)을 감소시키는 동시에BK_(Ca) current를 증가시켰으며 monensin을 처리하면BK_(Ca) current는 완전히 감소되었다. 이러한 결과는 세포 내 Na^(+)의 증가가BK_(Ca)를 억제함을 시사하는 것이다. 세포 내 Na^(+)의 농도는 background Na^(+) influx의 영향을 받으므로 이것이BK_(Ca)에 미치는 영향을 알아보았다. 우선 background Na^(+) influx가 내피세포에 존재하는지 막전압 측정을 통해 확인하였다. Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)의 안정막전압은 -8.1 ± 1.2 mV였으며 세포 외 Na^(+)을 NMDG^(+)나 mannitol로 치환하면 -55 mV까지 과분극되었다. 반면 Na^(+)을 Li^(+)으로 치환하는 것은 세포막전압에 영향을 주지 않았다. Voltage-clamped HUVECs에서 세포막전압을 과분극시키면 세포 내 Na^(+)이 증가하였으며 저분극시키면 반대로 감소하였다. 따라서 background Na^(+) influx와 세포막전압은 상호 간에 영향을 미쳐 세포 내 Na^(+) 농도를 결정하는데 기여한다는 것을 알 수 있다. Voltage-clamped whole cells에서BK_(Ca) current는 세포 외 Na^(+)이 감소할수록 커졌다. 이러한 Na^(+)의 조절 기전은 단일 이온통로 실험에서 더 명확히 볼 수 있었다. Inside-out patches에서 세포 내 K^(+) 농도를 140 mM로 고정하고 세포 내 Na^(+)을 증가시키면 single channel conductance는 감소하였으나 open probability (NPo)는 영향을 받지 않았다. 그러나 세포 내 Na^(+)을 고정시키고 K^(+)을 감소시키면 conductance와 NPo 모두 줄어들었다. K^(+)을 Na^(+)으로 치환시키면서 세포 내 Na^(+) 농도를 증가시키면 그 효과가 더 뚜렷해BK_(Ca)의 single channel conductance와 NPo 모두 감소하였다. 이상의 결과에서BK_(Ca), Na^(+)-K^(+) pump, NCX 및 background Na^(+) influx가 세포 내 Na^(+)과 K^(+) 농도의 변화를 매개로 서로가 밀접히 연관되어 움직인다는 것을 알 수 있다. 이러한 이온 통로들과 운반체들 간의 유기적인 상호 관계는 내피세포 내의 Ca^(2+) 농도 조절에도 영향을 주어 혈관 수축 기전에 관여할 것으로 생각된다.