Study on lysophosphatidylcholine‐induced cell death in human umbilical vein endothelial cells

Abstract

Objective: Endothelial dysfunction caused by lysophosphatidylcholine (LPC) is thought to contribute to the initiation and progression of preeclampsia via a process involving oxidative stress. The objective of the present study was to determine whether LPC induces endothelial cell death by altering the Ca^(2+)&#8208;dependant production of nitric oxide (NO) and thereby increasing oxidative stress. Study Design: Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were obtained from normal pregnancies in non&#8208;smoking women after cesarean delivery. HUVECs were cultured and exposed to up to 100 μM LPC, LPC with 100 μM N^(G)&#8208;nitro&#8208;l&#8208;arginine methyl ester (L&#8208;NAME, eNOS inhibitor), 10 μM LPC with 10 μM Lanthanum (La^(3+), Ca^(2+) influx inhibitor), or 100 μM LPC with antioxidants (750 μM vitamin C, 0.5 μM vitamin E, and 0.2 μM polyphenol). LPC&#8208;induced cell death and viability were determined using LDH and Resazurin assays. The production of intracellular Ca^(2+), nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) were measured using a microfluorimeter, fluorometric NO assay kit and fluorescence ELISA reader,respectively. The Mann&#8208;Whitney U test was used for statistical analysis. Results: LPC induced HUVEC death in a concentration&#8208;dependent manner, and the increase in intracellular Ca^(2+) induced by 2 μM LPC was significantly greater than that induced by 30 μM ATP (p<0.05). NO production induced by 10 and 100 μM LPC was significantly greater than that induced by 50 μM ATP (p<0.01). Treatment with 100 μM L&#8208;NAME, 10 μM La^(3+) or antioxidants inhibited LPC&#8208;induced cell death (p<0.05). These data suggest that LPC induces cell death via the overexpression of intracellular Ca^(2+) and overproduction of NO. Antioxidants inhibited LPC&#8208;induced cell death by reducing ROS production. Conclusion: These findings suggest that LPC induces the overexpression of intracellular Ca^(2+), resulting in the overproduction of NO, which may increase the oxidative stress on endothelial cells and lead to endothelial cell death. These results may explain the mechanism underlying the endothelial dysfunction caused by LPC.;목적: LPC에 의한 혈관내피세포 기능부전은 산화성 스트레스에 의한 자간전증 발병 및 병의 진행에 중요한 역할을 한다. 이 연구에서는 LPC가 인간 제대정맥 혈관내피세포에서 칼슘 의존성 산화질소 생성과 이것으로 인한 산화성 스트레스에 미치는 영향을 연구하여 LPC가 세포자살을 유도하는 기전과 이를 억제하는 항산화제의 역할에 대하여 알아보고자 하였다 연구 대상 및 방법: 비 흡연 정상 임신부에서 분만 후 제대정맥 혈청을 채취하여 제대정맥 혈관 내피세포를 분리하였다. 배양한 인간 제대정맥 혈관내피세포를 24시간 동안 LPC, LPC와 L&#8208;NAME, LPC와 란탄(Lanthanum) 그리고 LPC와 항산화제(750 μM 비타민 C, 0.5 μM 비타민 D, 0.2 μM 폴리페놀)에 노출시켰다. LPC에 의한 세포자살은 LDH assay와 Resazurine assay로 측정하였고 세포 내 칼슘 농도와 산화질소, 활성화 산소는 각각 미세형광 측정기(microfluorimeter), fluorometric nitric oxide assay kit, fluorescence ELISA reader로 측정하였다. 통계는 Mann Whitney U test를 이용하였다. 결과: LPC는 인간 제대정맥 혈관내피세포에 손상을 일으켜 결국은 세포 자살을 유도하며 이것은 LPC 농도에 비례하였다. LPC(2 μM)에 의한 혈관 내 칼슘이나 산화질소의 증가는 ATP에 의한 증가보다 통계학적으로 유의하게 컸으며 LPC에 의한 활성산소 생성도 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 또한 LPC에 의한 세포자살은 혈관 내피 세포 산화질소 합성효소(eNOS) 억제제인 L&#8208;NAME, 칼슘길항제인 란탄 (Lanthanum) 그리고 비타민 C, 비타민 D 그리고 폴리페놀 같은 항산화제에 의하여 억제되었다. 결론: 이 연구에서 LPC가 배양된 인간 제대정맥 혈관내피세포에서 세포 내 칼슘을 증가시키고 이것으로 인하여 산화질소가 과 생성되며 산소성 스트레스를 통하여 세포자살을 유도함을 알 수 있었다. 그리고 이러한 혈관내피세포 자살은 항산화제에 의하여 억제되며 따라서 임신 자간전증과 같은 혈관질환을 예방 및 치료하는데 비타민 C, 비타민 D 그리고 폴리페놀 같은 항산화제가 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 그러나 산화 저밀도 지단백이 세포자살을 유하는 기전과 이를 억제하는 항산화제에 대하여 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.