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Helicobacter pylori 유전자 HP0355, HP0668, HP0969의 산성 환경에서 성장할 수 있는 유전자적 특성

Title
Helicobacter pylori 유전자 HP0355, HP0668, HP0969의 산성 환경에서 성장할 수 있는 유전자적 특성
Other Titles
The genetic characteristics of HP0355, HP0668 and HP0969 genes of Helicobacter pylori to grow under acidic conditions
Authors
조지윤
Issue Date
2007
Department/Major
대학원 의학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Abstract
Helicobacter pylori (H. pylori)는 그람 음성 미 호기성 간균으로 산성 위 점막에서 생존할 수 있는 유일한 병독 세균이다. 산성 환경에서 생존할 수 있는 H. pylori의 산 저항성에 대한 연구는 지금까지 urease의 활성도에 초점이 맞춰져 있었다. 그러나, H. pylori가 낮은 pH에서 성장할 수 있는 기전은 단순히 생존하는 것과는 다르며, H. pylori가 산 저항성을 갖도록 해 주는 10개의 유전자에 대한 보고가 있었다. 본 연구에서는 산 저항성을 갖게 해 주는 10개의 유전자 중에서 urease 활성과는 연관성이 없는 HP0355 (a putative membrane GTPase), HP0668 (a hypothetical protein), HP0969 (a putative cation efflux system)을 대상으로 하였다. 우선, 세 유전자의 pH 변화에 따른 발현 차이를 보기 위하여, pH 7과 pH 4.8에서 성장한 야생형 SS1균주의 총 RNA를 분리하여 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 분석에 사용하였다. 다음으로, 각 유전자 부위에 항생제 내성 유전자인 aphA´3 (kanamycin 내성 유전자) 또는 catGC (chloramphenicol 내성 유전자)를 삽입하여 유전자를 비활성화시킨 돌연변이주를 제작하였다. 조작된 유전자를 갖고 있는 plasmid를 야생형 H. pylori SS1에 도입하 였고, 항생제 내성 유전자의 정확한 삽입으로 이루어진 돌연변이체의 형성은 PCR로 확인하였다. 이렇게 얻어진 돌연변이주와 야생형(SS1)을 생체 외 배양 실험과 쥐 실험으로 집락 형성 능력을 비교하여 세 유전자(HP0355, HP0668, HP0969)의 산 저항 특성을 알아보고자 하였다. 세 유전자의 pH 변화에 따른 발현차이를 본 결과, HP0668과 HP0969 mRNA는 pH 7에서 발현되었고, pH 4.8에서도 약하게 발현되었다. HP0355 mRNA는 pH 7에서만 발현되고 pH 4.8에서는 유전자 발현이 억제되었다. 중성 조건의 생체 외 혼합 배양 분석에서 HP0668과 HP0969 돌연변이의 생존력은 야생형과 비슷했고, HP0355 돌연변이의 생존력은 야생형보다 약했다. 쥐 감염 실험에서는 HP0668과 HP0969 돌연변이는 야생형에 비해 집락 형성 능력이 감소했고, HP0355 돌연변이는 야생형보다 집락 형성 능력이 증가했다. HP0355 돌연변이의 운동성 분석에서, HP0355 돌연변이가 야생형보다 운동성이 활발하였다. 결론적으로, HP0668과 HP0969는 주요 산 저항 유전자로 생각되며, 이 두 유전자를 비 활성화시킨 돌연변이주들은 중성 조건의 생체 외 혼합 배양에서는 야생형과 생존력이 비슷했지만, 쥐의 위 점막에서는 집락 형성 능력이 감소하였다. HP0355는 산에 대한 저항력은 약하나 운동성에 관계하여 산 저항성에 영향을 주는 유전자로 생각되고, HP0355 돌연변이는 중성 조건의 생체 외 혼합 배양에서는 야생형 SS1보다 생존력이 약했지만, 활발한 운동성을 획득하여 쥐의 위 점막에서 야생형 SS1보다 집락 형성 능력이 증가하였다. 본 연구에서 규명된 세 가지 유전자의 특성을 통해서 H. pylori가 위 점막에서 집락 형성을 하기 위해서 urease와 독립된 산 저항성의 영향을 받는 것을 확인할 수 있었고, 향후 H. pylori의 산 저항성을 결정 해 주는 세 가지 유전자이외의 다른 유전자들의 특성에 대한 연구를 지속한다면, H. pylori가 산성 위 점막에서 생존 및 성장하는 기전을 규명할 수 있을 것으로 기대된다.;Helicobacter pylori (H. pylori), a gram-negative microaerophilic bacterium, is known to be a unique gastric pathogen which can survive in the acidic gastric mucosa. The survival of H. pylori in acidic pH has been studied mainly focused on its urease activity. However, 10 genes that are essential for the growth of H. pylori at an acidic pH were reported. The purpose of this study is to evaluate the characteristics of 3 genes among these 10 genes related to acid-resistance system independently of urease activity. They are a locus encoding a putative membrane GTPase (HP0355), a locus encoding a putative cation efflux system (HP0969), and a locus encoding hypothetical protein with no known homologues (HP0668). First, to determine the pH-dependent transcription of these three genes, total RNA of the wild type SS1 grown at pH 7 and pH 4.8 was isolated and used for RT-PCR analysis. Next, allelic replacement mutagenesis were performed using the antibiotic resistance genes (aphA´3; kanamycin resistance gene or catGC; chroramphenicol resistance gene) to generate the insertional mutation in these three genes (HP0355, HP0668, HP0969) of H. pylori strain SS1. The viability of the wild type and its isogenic mutants was determined in in vitro competition assay and their colonization ability was studied using mouse experiment. In the RT-PCR analysis, HP0668 and HP0969 mRNAs were expressed at pH 7 and weakly expressed at pH 4.8. HP0355 mRNA was only detected at pH 7 but not at pH 4.8. In in vitro competition assay, the viability of HP0668 and HP0969 mutants wass similar to the SS1 strain (wild type), however, the HP0355 mutant showed the lower viability than the SS1 strain. Regarding the colonization ability, both HP0668 and HP0969 mutants showed a decreased ability to colonize mice. But, the HP0355 mutant was better able to colonize mice than the wild type. In motility assay, the HP0355 mutant had greater motility than the wild type. These results suggest that HP0668 and HP0969 are acid-resistance genes and their mutant strains show the lower colonization ability than the wild type in the mice. HP0355 is acid- sensitive gene but has the acid-resistant ability related to the motility. The HP0355 mutant has the higher colonization ability than the wild type because of the increased motility. This study showed that urease-independent acid resistance is important for gastric colonization by H. pylori. More studies regarding the characteristics of other acid-resistance-related genes will be needed to identify the full mechanism of H. pylori to grow under acidic conditions.
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