Identification and Functional Analysis of Matrix Metalloproteinases Expressed in Microglial Activation and Dopaminergic Neuronal Cell Death

Abstract

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-dependent endopeptidases that are activated by proinflammatory cytokines and oxidative stress and subsequently aggravate inflammation and neuronal cell death in the CNS. Therefore, aberrant expression of MMPs plays an important role in neurodegenerative diseases. However, their role in microglial activation and dopaminergic neuronal cell death remains unclear. In the first part, this study identified the expression of MMPs in activated microglia and analyzed their role in microglial activation. It was found that mRNA expressions of MMP-1, -3, -8, and -9 were significantly increased by treatment of immunostimulants, such as LPS and PMA, in primary microglia and BV2 microglial cells. In contrast, TIMP-2 mRNA expression was inhibited by the immunostimulants. In addition to mRNA level, the changes of MMPs and TIMP-2 were confirmed at protein level. To further analyze the role of MMP-3 and MMP-9, microglial cells were treated with MMP-3 or MMP-9-specific inhibitors before stimulation with LPS and the changes of inflammatory mediators (NO and TNF-α ) were analyzed. Both inhibitors significantly suppressed the production of NO and pro-inflammatory cytokines as well as the activities of NF-κB, AP-1, and MAP kinases. Next, the involvement of ROS in MMP expression and inflammatory mediators was examined. ROS inhibitors suppressed LPS-induced MMP-3, -9, NO, and TNF-α production, suggesting that ROS are early signaling inducers in microglial activation. To provide more direct evidence for the hypothesis that MMP-3 and MMP-9 may play a role as upstream inflammatory modulators in microglial activation, microglial cells were treated with recombinant MMP-3 and -9 proteins. MMP-3 significantly induced NO, TNF-α , and ROS generation, whereas the effect of MMP-9 was rather weak. From these results, it was proposed that microglial activation by LPS triggers ROS production, which accelerates sequential expressions of MMP-3, -9, and other inflammatory mediators such as iNOS and TNF-α . In the second part, this study demonstrated that dopaminergic neuron-specific toxins, 6-OHDA or MPP+ induced the expression of MMP-9, whereas they reduced the TIMP-2 expression in three types of dopaminergic neuronal cell lines. Treatment of MMP-9 inhibitors attenuated dopaminergic neuronal cell death induced by either 6-OHDA or MPP+, suggesting that MMP-9 play an important role in this neurotoxin-mediated cell death. Further mechanistic studies showed that 6-OHDA and MPP+ increased MMP-9 gene expression by inducing NF-κB and AP-1 binding to MMP-9 promoter. Treatment of PI3 kinase inhibitor (LY294002) suppressed 6-OHDA or MPP+-induced MMP-9 promoter activity, while p38 MAPK inhibitor (SB203580) inhibited 6-OHDA-, but not MPP+-induced promoter activity. The results suggest that common and differential signaling pathways are involved in 6-OHDA or MPP+-mediated MMP-9 expression. Moreover, ROS inhibition suppressed MMP-9 promoter activity induced by either 6-OHDA or MPP+, suggesting that ROS regulate MMP-9 expression induced by either 6-OHDA or MPP+. To investigate the role of TIMP-2 in dopaminergic neuronal cell death, TIMP-2 expression plasmid was transfected into dopaminergic cells and the cell survival was compared after treatment of 6-OHDA or MPP+. It was found that overexpression of TIMP-2 attenuated the cell death induced by 6-OHDA or MPP+. In addition, transfection of TIMP-2 siRNA aggravated 6-OHDA or MPP+-mediated cell death. Therefore, the results suggest that TIMP-2 plays a neuroprotective role in this neurotoxin-mediated cell death. The TIMP-2-mediated neuroprotection appears to be mediated through inhibition of MMP-9 because overexpression of TIMP-2 inhibited the 6-OHDA or MPP+-induced MMP-9 promoter activity. Collectively, the present study demonstrated the novel role of MMP-3 and -9 as inflammatory mediators in activated microglia and the neuroprotective role of TIMP-2 in dopaminergic neuronal cell death. Therefore, the inhibition of MMP-3/-9 or enhancement of TIMP-2 in microglia/neuronal cells may provide potential therapeutic strategies for various neurodegenerative diseases such as Parkinson’s disease.;Matrix metalloproteinase (MMP)는 아연 의존적인 단백질분해효소로서 염증성 싸이토카인과 산화적 스트레스에 의해 활성화되어, 중추신경계에서 염증과 뇌세포사멸을 악화시킨다. 따라서 MMP의 과도한 발현은 퇴행성 신경질환에서 중요한 역할을 하고 있다. 그러나 소교세포 활성화와 도파민성 신경세포 사멸에 있어 MMP의 역할에 대한 연구는 부족한 상태이다. 본 연구의 첫번째 Part에서는, 소교세포 활성화시에 발현되는 MMP들을 검색하고 소교세포 활성화에 있어서 그들의 역할을 규명하고자 하였다. 일차배양 소교세포와 BV2 소교세포주에 면역활성물질인 LPS와 PMA를 처리했을 때, MMP-1, -3, -8, -9의 발현이 증가하는 반면, TIMP-2의 발현은 감소하였다. 보다 상세한 MMP-3와 MMP-9의 역할을 알아보기 위해, 이들의 특이적인 억제제를 이용하여 LPS에 의한 소교세포 활성화 시 분비되는 NO와 TNF-α에 대한 영향을 살펴 보았다. 그 결과, MMP-3와 MMP-9 억제제 모두에 의해 NO와 TNF-α가 감소되었고, LPS에 의해 활성화되는 NF-κB, AP-1, MAP kinases의 활성도 감소하였다. 다음으로 활성산소종(ROS)과 MMP 발현 및 뇌 염증과의 관련성을 보았는데, ROS억제제는 LPS에 의해 유도되는 MMP-1, -3, -9의 발현과 NO 및 TNF-α 의 분비를 감소시켰다. 이를 통해, ROS가 소교세포 활성화의 초기 신호유도물질로서 작용함을 알 수 있었다. MMP-3와 MMP-9이 LPS에 의해 활성화된 소교세포에서 염증매개인자로서 작용할것이라는 가설을 직접적으로 증명하기 위해, 소교세포에 재조합 MMP-3와 MMP-9 단백질을 직접 처리하여 본 결과, 재조합 MMP-3 단백질은 NO와 TNF-α , ROS를 크게 생성시킨 반면, 재조합 MMP-9 단백질의 효과는 매우 약하였다. 이상의 결과를 통해, LPS에 의해 활성화된 소교세포는 ROS를 생성하고, 생성된 ROS는 MMP-3와 MMP-9의 발현, 그리고 iNOS와 TNF-α 와 같은 염증인자들의 발현을 촉진시키는 것으로 보여진다. 본 연구의 두번째 Part에서는, 도파민성 신경세포에 선택적인 독소인 6-OHDA와 MPP+가 세가지 도파민성 신경 세포주에서 MMP-9 발현을 유도하는 반면, TIMP-2 발현은 감소시킴을 확인하였다. 이때, MMP-9 억제제는 6-OHDA와 MPP+에 의해 유도된 신경세포 사멸을 감소시켰다. 이는 MMP-9이 신경독소에 의해 유도된 신경세포 사멸에 중요한 역할을 함을 시사한다. 보다 상세한 기전 연구를 통하여, 6-OHDA와 MPP+는 MMP-9 promoter 상에 있는 NF-κB와 AP-1 전사인자 활성화를 통해 MMP-9의 발현을 유도함을 확인하였다. 또한 PI3K inhibitor (LY294002)는 6-OHDA와 MPP+에 의해 유도된 MMP-9 promoter 활성을 억제하는 반면, p38 MAPK inhibitor (SB203580)는 6-OHDA에 의한 promoter 활성만을 억제하였다. 따라서 6-OHDA와 MPP+에 의해 유도되는 MMP-9 발현에 있어서 공통적이면서도 차별적인 신호전달체계가 존재함을 알 수 있었다. 더 나아가 ROS의 억제는 이들 신경독소에 의해 유도되는 MMP-9 promoter 활성을 감소시켰는데, 이는 ROS가 6-OHDA와 MPP+에 의해 유도되는 MMP-9 발현을 조절함을 나타낸다. 다음으로, 도파민성 신경세포 사멸에 있어서 TIMP-2의 역할을 연구하였다. TIMP-2를 과발현시킨 세포주는 6-OHDA와 MPP+만 처리한 세포주에 비해 세포 생존능이 향상되었고, TIMP-2 siRNA를 이용하여 TIMP-2 유전자를 억제시킨 세포주는 6-OHDA와 MPP+에 의한 세포 사멸이 증가하였다. TIMP-2를 과발현시키면, 6-OHDA와 MPP+에 의한 MMP-9 promoter 활성이 감소함을 확인하였는데, 이는 TIMP-2가 6-OHDA와 MPP+에 의한 세포사멸에 있어서, MMP-9을 억제함으로써 신경보호효과를 나타낼 가능성을 시사해 준다고 볼 수 있다. 결론적으로 본 연구에서는 MMP-3와 MMP-9이 활성화된 소교 세포에서 염증 매개인자로 작용한다는 새로운 역할과 도파민성 신경세포 사멸에 있어서 TIMP-2의 신경보호 효과를 확인하였다. 따라서 소교세포 및 신경세포에서 MMP-3와 MMP-9을 억제하고, 신경세포에서 TIMP-2를 증가시키는 것은 파킨스씨병과 같은 퇴행성 신경질환에 대한 치료 전략으로 유망할 것으로 사료된다.