THE EFFECTS OF TRANSCRIPTION FACTORS OF KAPOSI'S SARCOMA-ASSOCIATED HERPES VIRUS ON WNT SIGNALING PATHWAY

Abstract

카포시 육종 헤르페스 바이러스 또는 인간 헤르페스 바이러스 8은 사람에게 카포시 육종등의 암을 유발할 수 있는 바이러스이다. 카포시 육종의 발생은 잠재적에서 용해적 바이러스 유전자로의 발현이행이 중요한 기전으로, 이러한 카포시 육종 세포에서 표현되는 바이러스 단백질로는 ORF-59/RTA가 있다. Wnt 단백질신호기전은 세포의 활성, 형태, 움직임, 운명, 축형성 및 기관발달을 조절하는 기능을 가지고 있다. 이 신호기전에 이상이 생기면 암이나 골형성에 이상이 오는 것으로 알려져 있다. Wnt 단백질이 Frizzled 와 지단백질 수용체 관련 단백질 5/6 (LRP5/6)에 작용하면 β-catenin이 분해되지 않고 세포질내에 쌓여 핵내로 들어가 T세포전사인자 (Tcf)/림프성 상승인자 (Lef)와 결합하여 이에 관련된 여러 유전자의 발현을 자극시킨다. 따라서, 이 연구의 목적은 카포시 육종 헤르페스바이러스와 Wnt 신호기전사이의 상호작용과 그 기전을 밝히고자 함이다. 연구를 위하여 세포배양, 트렌스펙션, 리포터 분석, 면역형광법, 세포하 단백질 분석법, 공면역침천법, 웨스턴 블롯, 세포추출물 SDS-PAGE분석을 사용하였다. 본 연구에서는 RTA가 Tcf 의존성 전사를 활성화하는 것을 알 수 있었다. 이로부터 네 가지 가설을 세울 수 있었는데, 첫번째 RTA가 GSK3β에 부착하여 핵내로 들어감에 따라 β-catenin이 세포질내에서 증가하여 핵내로 들어와 Tcf를 증가시킨다는 가설이고, 둘째 RTA가 β-catenin을 핵내로 끌어당긴다는 것과, 셋째 RTA가 미지의 촉진체를 자극하고, 그에 따라 활성화된 유전자 단백질이 Wnt 신호기전을 활성화한다는 것이며, 마지막으로, RTA가 β-catenin 또는 GSK3β에 독립적으로 Tcf와 직접 상호작용한다는 가설이었다. 카포시 육종 헤르페스바이러스 단백질 중에서 RTA와 LANA만이 Tcf 의존성 전사과정을 활성화시켰다. 하지만, GSK3β나 β-catenin과는 상관없이 독립적으로 Tcf를 올리는 것을 알 수 있었으며, RTA가 β-catenin의 세포하 위치를 변형시키지도 않았다. RTA와 β-catenin이나 GSK3β사이에서도 상호작용이 없었다. RTA의 정확한 작용부위를 알기 위하여 RTA를 지도화하여 transcriptional activator domain (TAD)부분에 변이유발을 한 결과 변이유발된 단백질들은 변이유발하지 않은 원래의 단백질에 비해 Tcf 의존성 전사를 올리지 않았다. 따라서, 카포시 육종 헤르페스 바이러스는 생존하기 위해 이 Wnt신호기전을 사용하고, 카포시 육종에서 이 신호기전을 증가시키며, RTA의 TAD부분이 β-catenin 또는 GSK3β에 독립적으로 Tcf와 직접 상호작용하는 것을 알 수 있었다. 이 작용의 세부 기전과 생물학적 의미를 알기 위해 추가 부속적인 연구가 필요할 것이다.;Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) or human herpesvirus 8 (HHV8) is known to cause cancer in human. Kaposi's sarcoma (KS) is a complex neoplasm characterized by marked hyperplasia of spindle cells of endothelial lineage and shows striking concomitant neoangiogenesis. The switch from latency to lytic cycle depends on a viral gene expression of KSHV, an important component of the pathogenesis of KS. Viral proteins that are found to be expressed in rare cells of KS lesions include processivity factor-8 (PF-8/ORF 59) and regulator of transcription activation (RTA/ORF 50). Wnt proteins constitute a large family of cysteine-rich secreted ligands that control development in organs ranging from nematode worms to mammals. The intracellular signaling pathway of Wnt regulates cellular proliferation, morphology, motility, fate, axis formation, and organ development. It has been shown that abnormalities of this pathway lead to tumor and bone abnormalities. When Wnt acts on its cell-surface receptor consisting of Frizzled and lipoprotein receptor-related protein 5/6 (LRP5/6), β-catenin escapes from degradation in the Axin complex. The accumulated β-catenin is translocated to the nucleus, where it binds to the transcription factor T cell factor (Tcf)/ lymphoid enhancer factor (Lef) and thereby stimulates the expression of various genes. KSHV is an oncogenic virus, so we hypothesized that KSHV might use Wnt signal pathway, resulting in KS. Therefore, the purpose of this study is to find out the interactions between KSHV and Wnt signal pathway and specify this mechanism. We did biochemical study using cell culture, transfection, reporter assay, immunofluorescence, subcellular fractionation of proteins, co-immunoprecipitation, western blotting, and SDS-PAGE analyses of cellular extracts, Our results showed that RTA activated Tcf-dependent transcription, which is specific for Wnt signaling pathway. From this novel finding, we could make four hypotheses. First, RTA binds with GSK3β and they are translocated into nucleus. Therefore, unphosphorylated β-catenin is increased in the cytoplasm and is also translocated into nucleus, sequentially increasing Tcf. Second, RTA pulls β-catenin into nucleus. Third, RTA activates unknown promoter and a resulting unknown activated gene protein product activates Wnt signal pathway. Lastly, RTA interacts directly with Tcf independent of β-catenin or GSK3β. RTA increased Tcf luciferase activity independent of LiCl, which is a GSK3β inhibitor and β-catenin. And transcriptional activation domain (TAD) of RTA was important in Tcf-dependent transcription. The RTA mutants did not change β-catenin level. RTA did not change subcellular localization of β-catenin. GSK3β was detected only in cytoplasmic fraction independent of RTA mutants. The co-immunoprecipitation assay indicated that RTA was not associated with β-catenin or GSK3β. Taken together, we knew that TAD of RTA interacted directly with Tcf independent of β-catenin or GSK3β.