동물 모델로서 XVII형 교원질 유전자 제거 제브라피쉬의 유용성

Abstract

Background: The zebrafish, Danio rerio, small fresh water fish has been established as an ideal model for the study of development and genetics due to many advantages which are mentioned below; it is easy to get, generation time is short as 2 to 3 months, a single female can lay up to 200 eggs per week and its embryos are easy to observe because they are optically transparent during first few days. By day 3 all of the important organs are formed. It has stratified epidermis, consisting of basal layer and periderm, and hemidesmosomal structure in basal cells like human epidermis, which is easy to understand the development of human epidermis. Objectives: To evaluate usefulness of zebrafish as an experimental animal of collagen XVII Methods: We cloned zebrafish type XVII collagen cDNA using RACE-PCR and pCR4??-TOPO vector and analysed cDNA sequence by automated methods. Using 5' untranslated region of its sequence, antisense morpholino oligonucleotides were ordered and injected to individual zebrafish embryos, which were at the 1- to 4-cell stage. We observed alterations of phenotype using stereoscope, light microscope and transmission electron microscope. Results: 1. In stereoscopic and microscopic findings of morpholino -induced collagen XVII knockout zebrafishes, they were smaller than wild type zebrafishes and showed curved tail, roughness of body surface, short pectoral fins, bullae on dorsal and lateral trunk. 2. Semithin sections showed separation between epidermis and dermis along the cephalocaudal axis and intact integrity of basal epidermal cells and outermost peridermal cells. 3. Transmission electron microscopic findings of bullous lesion in knockout zebrafish showed the loss of hemidesmosomal attachment plaque and lamina densa in basement membrane zone. 4. Collagen XVII protein was expressed in the wild type zebrafish but not expressed in the knockout zebrafish by Western blot analysis. Conclusions : Zebrafish collagen XVII protein showed highly homology with human collagen XVII. After collagen XVII-targeted morpholino injection, subepidermal blister developed due to hemidesmosome loss such as bullae which are observed in BP & GABEB. Zebrafish will be used experimental animals for research of collagen XVII.;제브라피쉬(zebrafish, Danio rerio)는 척추동물 발달 과정의 연구에 널리 이용되는 동물로 쉽게 구할 수 있고, 세대 기간(generation time)이 2-3 개월로 짧으며, 암컷 한 마리가 일주일에 200-300 개의 알을 낳으며, 출생 후 첫 수 일간 투명하게 관찰되어 내부 장기의 변화를 외부에서 쉽게 관찰할 수 있고, 생후 첫 3 일 안에 중요 장기가 모두 형성되는 점 등 실험동물로서의 장점을 가지고 있다. 제브라피쉬의 표피 구조가 포유동물과 유사하고 제브라피쉬의 표피 발달에 필요한 여러 유전자들이 상위의 척추동물의 표피 발달에도 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀져 제브라피쉬의 표피에 대한 분석이 인간의 표피 발달에 대한 이해를 도울 수 있을 것으로 생각되고 있다. 본 연구의 목적은 제브라피쉬의 XVII형 교원질이 인간의 XVII형 교원질과 높은 상동성을 보이므로 제브라피쉬를 XVII형 교원질에 관한 연구에 이용할 수 있을지 알아보고자 하였다. 이미 밝혀진 제브라피쉬 XVII형 교원질의 염기서열을 확인하기 위하여 cDNA 복제(cloning)을 시행하고 기존의 서열과 일치하는지 확인한 후 이 염기서열로 XVII형 교원질을 대상으로 하는 안티센스 morpholino를 제브라피쉬의 수정란에 주입하여 XVII형 교원질 유전자제거 제브라피쉬를 만들고 형질 변화를 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. XVII형 교원질 유전자 제거 제브라피쉬는 정상 제브라피쉬에 비해 크기가 작고 꼬리가 구부러지며 가슴지느러미와 꼬리지느러미의 발달이 미숙하며 몸체의 등 쪽과 양 측면에서 수포가 관찰되었다. 2. 반초박절(semithin) 광학현미경 소견에서 머리 쪽에서 꼬리 쪽으로의 장축을 따라 표피와 진피 사이의 분리가 관찰되었으며 기저층과 가장 바깥쪽의 외피의 세포 간 결합은 유지되고 있었다. 3. 전자현미경 소견에서 유전자 제거 제브라피쉬의 수포부위의 반교소체 부착반과 기저판이 소실되었다. 4. Western blot 분석으로 XVII형 교원질이 정상 제브라피쉬에서는 발현되나 유전자 제거 제브라피쉬에서는 발현되지 않아 표현형의 변화가 XVII형 교원질의 소실에 의한 것임을 확인하였다. 이상의 결과로 인간의 XVII형 교원질 유전자의 소실로 인한 질환과 유사한 형질의 변화를 XVII형 교원질 유전자 제거 제브라피쉬에서 관찰하였으며 제브라피쉬는 사람과 유사한 표피구조와 기저막대의 구조를 가져 XVII형 교원질 유전자뿐 아니라 나아가서는 반교소체를 구성하고 있는 단백들의 구조 및 기능에 관한 연구의 동물 모델로 쉽고 간편하게 이용할 수 있을 것으로 생각된다.