Prognostic value of p16^(INK4a) and p14^(ARF) gene hypermethylation in human colon cancer

Abstract

INK4a/ARF locus (9p21)는 서로 다른 별개의 두 유전자, p16^(INK4a) 과 p14^(ARF) 유전자를 전사한다. 본 연구에서는 대장암으로 수술 받은 환자 65명의 종양과 정상조직에서 p16^(INK4a) 과 p14^(ARF) 유전자의 메칠화에 의한 비활성 여부를 검사하였고, 그 결과와 p16 및 p53 단백의 면역염색과 현미부수체 불안정성, 그리고 예후와 관련이 있는 임상소견과 병리소견과의 상관관계를 분석하였다. p16^(INK4a) 과 p14^(ARF) 유전자의 메칠화는 종양과 정상조직의 파라핀블록에서 DNA를 추출하여 메틸화 특이 중합효소연쇄반응으로 검사하였다. p16 및 p53 단백의 발현은 면역염색으로 평가하였고, 현미부수체 불안정성은 중합효소연쇄반응으로 검사하였다. 65 예 중 21예(32.3%)가 p16^(INK4a) 유전자의 메칠화를 보였으며 33예(52.3%)는 p14^(ARF) 유전자의 메칠화를 보였다. p16^(INK4a)유전자의 메틸화는 p16 단백 음성반응과 상관관계를 보였으며(p=0.021), p53 단백 양성반응과 상관관계가 있었다(p=0.007). p16^(INK4a) 유전자의 메틸화는 분화가 나쁜 종양에서 더욱 자주나타났다(p=0.002). p14^(ARF) 유전자의 메틸화는 50세 미만의 환자에서, 그리고 좌측 대장에서 좀 더 자주 발생하는 경향을 보였지만 통계적으로 유의하지는 않았다. p16^(INK4a) 과 p14^(ARF) 유전자가 같이 메칠화를 보인 증례(10 예)가 p16^(INK4a) 과 p14^(ARF) 유전자 모두 정상이거나 둘 중 하나만 메칠화를 보인 증례에 비하여 림프절 전이를 더 자주 보였으며(p=0.020), 종양의 분화가 덜 되어서(p=0.049), 나쁜 예후인자와 상관관계가 있는 것을 알 수 있었다. 또한 통계학적으로 유의하지는 않았지만 p53 단백의 발현이 증가되고(p=0.055), 좌측 대장에서 발생한 암에서 더 자주 발현하는 경향을 보였다(p=0.053). 두 유전자의 메칠화는 서로 상관관계가 없었다. 정상 대장 점막에서 p16 단백은 음성인데 비해서 종양에서는 49.2%가 양성반응을 보였는데, p16 단백의 발현 여부에 따른 병리소견 및 임상소견의 차이는 보이지 않았다. p53 단백은 67.7%가 양성이었는데, 이들은 분화가 나쁜 종양과 병기가 높은 종양과 상관관계가 있었다. 현미부수체 불안정성을 검사한 61예의 대장암 중 7예(10.8%)에서 현미부수체 불안정을 보였는데, p16^(INK4a) 및 p14^(ARF) 유전자의 메칠화와 현미부수체 불안정은 서로 상관성이 없었다. 65 예의 대장암의 p16^(INK4a) 및 p14^(ARF) 유전자의 메칠화를 분석한 본 연구를 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 첫째, p16^(INK4a)유전자와 p14^(ARF) 유전자는 대장암에서 자주 메칠화를 보였는데, 이들 유전자의 메칠화는 정상조직에서는 관찰되지 않았다. 둘째, p16^(INK4a) 및 p14^(ARF) 유전자 메칠화는 서로 상관관계가 없었으며, p16^(INK4a) 유전자나 p14^(ARF) 유전자의 메칠화를 보인 대장암은 서로 다른 임상소견과 병리소견과의 연관성을 보였다. 셋째, p16^(INK4a) 유전자 및 p14^(ARF) 유전자의 메칠화는 현미부수체 불안정성과 연관성이 없었다. 넷째, p16^(INK4a) 유전자와 p14^(ARF) 유전자 모두 메칠화를 보인 대장암은 여러 가지 나쁜 예후인자와 연관성이 더 많았다. 이와 같은 결과로 p16^(INK4a) 유전자와 p14^(ARF) 유전자의 메칠화를 같이 검사하는 것은 각 유전자의 메틸화를 검사하는 것보다 예후를 예측할 수 있는 인자로서의 의미가 큰 것을 알 수 있었다. 또한 많은 수의 대장암과 대장선종에서 여러 유전자의 메칠화를 검사하면 대장암의 발생과 진행에 관여하는 유전인자의 역할을 추측하는데 도움이 될 것이라고 생각한다.;The INK4a/ARF locus (9p21) encodes two unique and unrelated proteins, p16^(INK4a) and p14^(ARF), which are transcribed from different promoters located in alternative first exons. This study was performed to evaluate the methylation status of p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes and its association with p16 and p53 protein expression, microsatellite instability (MI) status, and various clinicopathologic parameters in sporadic colorectal cancer. Sixty-five cases of primary colorectal adenocarcinomas with a series of clinicopathologic parameters were obtained. Methylation-specific PCR of p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes and MSI were performed in colorectal cancer paraffin blocks with its paired normal samples as well as immunohistochemical stainings for p16 and p53 protein. Aberrant methylation of p16^(INK4a)gene was present in 21 of 65 cases (32.3%). Aberrant methylation of p14^(ARF) gene was present in 33 of 65 cases (52.3%). p16^(INK4a) aberrant methylation was correlated with the p16 protein negativity (p=0.021) and p53 overexpression (p=0.007). p16^(INK4a) aberrant methylation was present more frequently in poorly differentiated adenocarcinomas (p=0.002). Aberrant methylation of p14^(ARF) gene occurred more frequently in patients under the age of 50 years and in left-sided colon cancers, which were not statistically significant. Compared with the group of simultaneous absence of methylation in both promoters, the group showing concomitant alterations in both p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes (n=10) presented more frequent lymph node metastasis (p=0.020), poorly differentiated adenocarcinoma (p=0.014), and the tendency for more frequent p53 overexpression (p =0.055), and being located at left-sided colon (p=0.053). There was no correlation between p16^(INK4a) and p14^(ARF) gene hypermethylation or MI status. From the present study of analyzing both methylation status of p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes as well as p16 and p53 protein expression and MI status in 65 primary colorectal cancer, following results were obtained: 1) Both p16^(INK4a) and p14^(ARF) gene hypermethylation were frequently associated with colorectal carcinoma. 2) Since no methylation was observed in normal adjacent mucosa, the methylation observed in the colorectal carcinoma was tumor-specific change. 3) Aberrant methylation of p14^(ARF) gene was more frequent in colorectal cancer and occurred independently of the p16^(INK4a) methylation status. 4) Aberrant methylations of p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes showed different biological association. 5) The cases with concomitant alterations of both p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes were associated more frequently with diverse worse prognostic parameters than the cases with exclusive p16^(INK4a) or p14^(ARF) methylation alone. 6) The p53 protein overexpression was noted in 67.7% of cases and was associated with poor differentiation and high stage of tumor (p=0.034 and 0.030, respectively). 7) Compared with normal colonic mucosa, in which no p16 expression was observed, p16 protein was overexpressed in 49.2% of colorectal cancers. 8) The positive and negative subgroups of p16 protein expression did not show any correlation with various clinicopathologic parameters. 9) MSI was noted in 10.8% of cases and occured more frequently in patients under the age of 50 years (p=0.001) and was noted more frequently in right-sided colon cancer (p=0.048). In conclusion, it can be suggested that simultaneous hypermethylation of both p16^(INK4a) and p14^(ARF) genes has more meaningful prognostic value in sporadic human colorectal cancer. Further study on methylation status of other genes with more numbers of colorectal cancers as well as adenomas will be helpful for defining the genetic changes occurring in colorectal carcinogenesis and progression of tumor.