골수와 제대혈의 줄기세포의 생체외 배양을 통한 간세포로의 분화유도

Abstract

Objective: The purpose of this study was whether stem cells from human umbilical cord blood and bone marrow are able to generate mature hepatocyte lineage cells in ex vivo culture system. Methods: Mononuclear cells from cord blood and bone marrow were cultured with fibroblast growth factor-1, fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and hepatocyte growth factor. Morphology of cultured cells was monitored in inverted light microscopy. Cultured cells were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction, immunofluorescent staining for detecting hepatocyte lineage markers and by flow cytometry for demonstrating specific hepatocyte lineage differentiation rather than hematopoietic one. Results: Cutured mononuclear cells differentiated to large round shaped cells. In immunofluorescent staining, cultured cells expressed albumin, cytokeratin-19 and some of the albumin producing cells contained PCNA. mRNA of albumin, cytokeratin-18 and alpha-fetoprotein were detected by RT-PCR. Cellular differentiation toward hepatocyte lineage cells was observed by flow cytomery analysis. Conclusions: Stem cells in human umbilical cord blood as well as bone marrow can differentiate toward hepatocyte lineage cells in primary culture system ex vivo and may serve a cell source for cell therapy of hepatic tissues.;본 연구에서는 인간의 골수와 제대혈의 두 상이한 조직에서 얻은 성체 줄기 세포가 간세포 성장 과정에 작용하는 것으로 알려진 성장인자들을 이용한 동일 조건의 배양 실험하에서 간세포로 분화가 가능한지 관찰해보고자 하였다. 환자 동의하에 얻은 제대혈과 골수에 Ficoll-Paque 용액을 첨가한 후 원심분리하여 단핵세포를 추출하였다. 분리된 단핵세포를 배지에서 배양하였는데 간세포 분화 발달 단계에 작용하는 것으로 알려진 fibroblast growth factor 1, 2(이하 FGF-1,2), Stem cell factor(이하 SCF), hepatocyte growth factor(이하 HGF)를 첨가하였다. 21일간 배양하면서 세포의 형태를 관찰하였고 간세포계열로 분화하였는지 판단하기 위해 간세포에서 나타나는 표지자들을 역전사 중합효소 연쇄반응, 면역형광염색, 흐름세포 측정법 등을 이용하여 분석하였으며 그 결과는 다음과 같았다. 1) 제대혈과 골수에서 분리한 단핵세포들은 성장 인자들을 첨가한 배지에서 배양하자 균질한 난원형의 커다란 세포들로 분화하였다. 2) 역전사 중합효소 연쇄반응 검사에서 골수와 제대혈의 배양세포 모두에서 간세포 계열 표지자인 albumin, cytokeratin-18(이하 CK-18), alpha-fetoprotein(이하 AFP)의 mRNA가 관찰되었다. 3) 면역형광염색에서도 제대혈 배양 시간이 경과할수록 albumin과 cytokeratin-19 (이하 CK-19)의 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고 골수 배양 7일째에도 albumin과 CK-19가 강하게 발현되었다. 간세포의 표지자를 발현하는 세포들의 증식 능력을 보기 위하여 proliferating cell nuclear antigen(이하 PCNA)으로 염색하였을때 albumin을 발현하는 세포들에서 PCNA가 발현되어 간세포 계열로 분화한 세포들이 증식 능력도 있음을 보여주었다. 4) 흐름세포측정법을 이용하여 배양된 골수 단핵세포들의 표현형을 분석하였는데 간세포계열 표지자인 CK-18는 배양 기간이 경과할수록 증가하는데 비하여 조혈세포 계열의 표지자들은 감소하는 것이 관찰되어 본 연구에서의 배양 조건은 줄기세포가 간세포 계열로 분화하도록 하였다는 것을 알 수 있었다. 골수와 제대혈에서 분리한 줄기세포는 FGF-1, FGF-2, SCF, HGF를 첨가한 배양 실험에서 간세포계열 세포로 분화하였으며 이는 줄기세포를 필요한 간세포로 특이적으로 체외에서 분화시켜 임상적 활용의 가능성을 보여 주었다.