영하 20℃ 냉동 보관된 지방세포의 적절한 이식 시기에 대한 고찰

Abstract

자가 지방 이식은 1893년 Neuer가 최초로 유리 지방 이식을 실시한 이래로, 1980년대 후반 지방 흡입술의 발달, 지방 분리 및 재주입 과정의 발달과 더불어 안면 비대칭 개선, 노화로 인한 연부조직 위축, 주름 개선, 그리고 융비술 등과 같은 미용 성형에 사용되고 있다. 자가 지방은 쉽게 채취가 가능하고, 상대적으로 저렴하며, 체내 이물반응 등 합병증의 위험이 적은 안전한 보형물로 인식되고 있으나, 자가 지방 이식의 흡수율이 20-90%까지 다양하게 보고되는 등 개인의 상태, 수술 방법 등에 따라 흡수율 차이가 많아, 그 결과를 예측할 수 없는 단점이 있다. 따라서 최근에는 채취된 자가 지방의 일부를 냉동 보관한 후 일정 시간이 지난 뒤 흡수된 만큼 이식 부위에 재주입하는 방법이 시도되고 있다. 이에, 냉동 보관된 자가 지방의 재주입시 생착율을 높이기 위해 냉동 지방의 변화에 대한 연구가 중요한 문제로 대두되고 있다. 냉동으로 인한 세포 손상 시, 세포 형태의 변화가 일어나고, 미토콘드리아 활성이 감소되며, 세포막의 파괴로 세포내 구성물의 외부 유출과 함께 세포막을 구성하고 있는 지질 성분의 변성 및 조성의 변화가 일어나게 된다. 이에, 21-45세 여성 70명을 대상으로 복부 지방 세포들을 채취, 영하 20℃ 로 냉동 보관한 후, 총 6개월의 기간 동안 1개월 간격으로 보관된 지방 세포들의 육안적 부피 감소 및 형태학적 변화를 관찰하여 냉동 기간에 따른 세포 파괴의 정도를 알아보고, 지방세포가 파괴된 부산물인 지질 성분의 분석을 통해 냉동으로 인한 세포 변성 유무를 확인하며, 냉동된 세포의 미토콘드리아 활동도 변화를 측정하여, 각각의 결과를 대조군인 채취 직후의 지방 조직과 비교하고 이를 토대로 냉동 지방의 생존력 및 세포 냉동의 안정성을 실험하였다. 실험 결과, 영하 20℃ 냉동 1개월-6개월에 걸쳐 지방세포의 부피 감소는 각각 0.82%, 3.07%, 12.83%, 15.06%, 15.67%, 16.15% 로서, 냉동된 지방세포의 부피 감소는 냉동 3개월째 이르러 지방세포의 용적의 급속한 감소를 보였다. 유출된 지방산의 조성은 myristic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid 및 linoleic acid의 6개의 지방산이 검출되었으며, 이들의 함량 및 총 지질량은 냉동 전 기간에 걸쳐 대조군과 유사한 소견을 보였을 뿐 아니라, 포화지방산에 대한 다가불포화 지방산의 비 역시 대조군과 유사한 소견을 보였다. 또한, 냉동 보관된 지방 세포의 형태학적 모양도 흡입 직후의 지방세포의 모양과 유사한 형태를 보일 뿐 아니라, 냉동 전 기간에 걸쳐 비전형적 지방세포의 증가는 보이지 않았다. 지방세포의 미토콘드리아 활성은 냉동 1개월 시 이미 감소되었으나, 냉동 기간에 따른 추가적인 감소는 없었으며, 냉동 전 기간에 걸쳐 냉동 전 상태의 50% 이상의 미토콘드리아 활성이 유지되는 소견을 보였다. 결론적으로 채취 당시 2단계 세포 손상으로 진행된 지방 세포들은 영하 20℃ 냉동 1개월 이내에 비가역적 손상으로 진행하게 되어, 냉동 3개월을 전후하여 채취된 지방의 유의한 부피 감소가 유발되고, 이 때의 부피 감소는 손상된 지방세포의 단순 파괴와 미토콘드리아 활성이 떨어지고 이미 세포 형태의 변형이 일어난 지방세포에서 유출된 내용물의 결과이며, 냉동 자체로 인한 추가적인 지방세포의 변성이나 부가반응으로 인한 지질 성분의 변화는 없었다. 또한 채취한 지방을 6개월 동안 냉동 보관 시라도 냉동 전 상태와 비교하여 50% 이상의 미토콘드리아 활성을 유지되면서 형태와 부피가 일정하게 유지되었으므로 냉동 보관된 지방 세포의 생체 내 재주입이 안전하고 효과적인 방법임을 예상할 수 있었을 뿐 아니라, 실제 임상에서 냉동 지방을 이용할 수 있는 시기는 이식된 지방의 완전한 생착이 이뤄지는 시기인 이식 후 1개월 이후이므로, 50% 이상의 세포 활성을 유지하는 동시에 지방 이식 시 수혜부의 연부 조직 형태와 부피를 최대로 유지할 수 있기 위해서는 영하 20℃ 냉동 보관된 지방세포의 부피가 최대로 유지되는 냉동 3개월 이전의 지방 세포를 이용하는 것이 지방 이식으로 인한 최대의 부피 확장 효과를 얻을 수 있을 것으로 추측할 수 있다. 그러나 손상 받지 않은 지방세포를 채취할 수 있는 방법에 대한 자세한 연구가 필요할 뿐 아니라, 가역적 손상 세포들이 비가역적 손상 단계로 진행되지 않고, 미토콘드리아 활성을 유지할 수 있는 냉동 조건에 대한 연구가 추가적으로 필요할 것으로 사료된다.;The use of autologous fat grafts for soft-tissue augmentation has an extensive history, but it has question on a clinical value due to unreliable grafts survival. It has been proposed that the morphological alteration of adipocytes and the number of viable cells at the time of transplantation correlates with ultimate fat graft survival volume. For the purpose of improving graft survival, many techniques are developed such as re-implantation of cryopreserved adipocytes. The purpose of this study is to find out the alterations of adipocyte volume and chemical composition, to determine the degree of decline in viability of cryopreserved adipocytes, and to find out efficient long-term storage period. Aspirated abdominal adipose tissues were collected from healthy young women (21-45 yrs, n=70) with syringe suction. After centrifuging with 3600 rpm for 1 minute, upper oil and lower blood layer were removed. 10ml of packed adipocytes were frozen at -20℃. 10 frozen samples were taken with one-month interval for 6 months, thawed at room temperature and re-centrifuged with same maneuver. The volume changes of packed adipocytes were measured and histological appearances of remained adipocytes were compared with H & E stain. Total lipid contents and the fatty acid compositions of the end product of upper oil layer were analyzed with gas liquid chromatography. Polyunsaturated fatty acid and saturated fatty acid ratio were also measured. Cellular mitochondrial activities were studied with XTT assay. Significant volume changes were observed in cryopreservation within less than 3 months(p<0.05). The profiles of total lipid and free fatty acid obtained from destructed upper oil layer were not changed and no significant difference in saturated fatty acid ratio. No histological changes in morphology of adipocytes were observed, independent from the freezing period. The reduction of mitochondrial enzymatic activity in cryopreserved adipocytes was observed independent from time interval but activity of mitochondrial dehydrogenase was reduced less than 50% compared with control. On the basis of these quantitative data, -20℃ freezing for 6 months has no adverse effect to adipocytes, but fragile adipocytes with damaged cell membrane during harvest procedure were disrupted within 1 month and the maximum volume reduction were followed within less than 3 months. These results demonstrate that tissue preparation cells with no cell membrane damage have the greatest viability level and cryopreservation itself has no harmful effect on adipocytes.