Probing antibacterial effect of tea polyphenol(-)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG) against Escherichia coli and Staphylococcus aureus using Atomic Force Microscopy

Abstract

(-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG), a main constituent of tea catechins, has antibacterial properties against many Gram-positive and Gram-negative bacteria including antibiotic-resistant pathogens. It is well known that synergy between EGCG and β-lactams against gram-positive bacteria arises from the fact that both compounds directly or indirectly attack the same peptidoglycan site on the cell wall. However, the sole antibacterial effects of EGCG have not been well studied. Atomic force microscopy (AFM) is highly useful for studying the topology and mechanical properties of surface and has been utilized to study the morphological changes of the bacterial cell wall induced by antibacterial agents. In Chapter I, the principle and microbiological application of AFM as well as the cell wall structures of Gram-positive and Gram-negative bacteria were briefly reviewed. In Chapter II, the morphological changes occurring in the cell wall of both Gram-positive and Gram-negative bacteria upon treatment of EGCG at sub-minimum inhibitory concentrations (sub-MICs) were observed by AFM. A major change in the cell wall of Staphylococcus aureus, a Gram-positive pathogen, was aggregation, while the major change in the cell wall of Escherichia coli O157:H7, a Gram-negative pathogen, was groove formation. Since E. coli O157:H7 tpx mutant, which has defects in thioredoxin-dependent thiol peroxidase (Tpx), was more seriously damaged by EGCG than its wild-type strain, it is suggested that the oxidative stress exerted by EGCG plays an important role in attacking the cell wall of Gram-negative bacteria. In the following chapter, AFM indentation method was used to analyze the changes of mechanical properties on the cell wall of S. aureus and E. coli O157:H7 induced by either EGCG or hydrogen peroxide (H2O2). Both EGCG and hydrogen peroxide altered the mechanical properties of E. coli O157:H7 in a similar extent, while the antibacterial agents differentially altered mechanical properties of S. aureus. Taken the indentation results with the topological results, it is suggested that EGCG directly bind to the peptidoglycan layer and disturb the cell wall of S. aureus due to the lack of the thick outer membrane, while it only exerts oxidative stress to the cell wall of E. coli O157:H7 due to the presence of the thick layer. It is also suggested that AFM is a great tool for understanding the effects of antimicrobials affecting the structure of the cell wall of bacteria because it provides researchers with topological data as well as mechanical data about the cell wall of bacteria of interest. ;녹차 카테킨의 주성분인 (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)는 항생제내성 병원성미생물을 포함한 많은 Gram-positive 와 Gram-negative 박테리아에 대하여 항 박테리아 작용이 있다고 알려져 있다. EGCG와 β-lactam 항생제들 사이의 synergistic 작용은 두 화학물질이 직접적 혹은 간접적으로 같은 사이트인 세포벽의 구성물질-peptidoglycan를 공격함으로 서 이루어진다고 알려져 있다. 하지만 EGCG 자체의 항 박테리아 작용에 대해서는 연구가 되어있지 않다. Atomic force microscopy (AFM)은 미생물의 형태와 표면의 물리적인 성질을 연구하는데 매우 유용하다고 알려져 왔으며 따라서 본 논문에서는 원자현미경 (AFM)을 사용하여 싱글 박테리아 레인지에서 EGCG가 가지는 항 박테리아 작용에 대하여 연구하였다. Chapter I 에서는 AFM의 원리와 미생물연구에서의 응용, 그리고 Gram-positive 와 Gram-negative의 세포벽 구조에 관하여 간단한 review를 진행하였다. Chapter II 에서는 sub-minimum inhibitory concentrations (sub-MICs) 농도에서 EGCG가 Gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus) 와 Gram-negative Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7)의 표면 morphology에 일으키는 변화를 원자현미경을 사용하여 관찰하였다. EGCG를 처리한 후 Gram-positive S. aureus표면에는 aggregation이 일어났으며 Gram-negative E. coli O157:H7 표면에는 grooves가 각각 형성되었다. 또한 같은 농도의 EGCG를 처리한 후 E. coli O157:H7의 tpx mutant (oxidative stress 에 약한 유전자변이 균주)는 wild-type보다 더욱 심하게 damage 되었다. 그러므로 EGCG가 Gram-negative 박테리아의 세포벽을 공격하는 과정에서 EGCG가 만들어 내는 oxidative stress가 중요한 작용을 한다는 것을 알 수 있다. 이어지는 chapter에서는 AFM indentation방법을 사용하여 EGCG와 hydrogen peroxide (oxidative stress)가 S. aureus 와 E. coli O157:H7 표면의 stiffness, turgor pressure, 그리고 stickiness등과 같은 물리적 성질에 미치는 영향을 연구하였다. EGCG와 hydrogen peroxide는 E. coli O157:H7 표면의 물리적 성질을 비슷하게 변화시키는 반면 S. aureus 표면의 물리적 성질은 서로 다르게 변화시켰다. Morphology결과와 indentation결과를 종합하여 보면 S. aureus 에는 두꺼운 outer membrane구조가 존재하지 않기 때문에 EGCG는 직접적인 binding을 통하여 세균의 세포벽을 공격하지만 E. coli O157:H7 에서는 outer membrane 구조 때문에 oxidative stress를 통해서만 세균을 공격한다는 것을 알 수 있다. 또한 AFM은 미생물 표면의 구조와 물리적 성질을 동시에 연구 할 수 있는 장점을 가지고 있으며 따라서 항생제들이 미생물의 세표벽에 주는 영향을 연구하기에 매우 적합한 툴이라는 것을 알 수 있다.