Simple and Sensitive Fluorescence Assay of Protective Antigen Using DNA and DNA-Peptide Conjugate

Abstract

본 논문에서는 DNA와 peptide을 이용하여, PA (보호 항원, protective antigen)과 결합함에 따라 형광의 세기가 변하는 aptasensor와 관련된 연구를 하였다. PA를 이용한 바이오센서들은 항원 항체 반응을 바탕으로 하는 바이오칩에 대한 연구가 활발히 되고 있다. Part 1. 에서는 DNA에 별도의 라벨링 과정 없이 PA와 결합함에 따라 형광의 세기가 변하는 형광 앱타센서를 연구하였다. 이 연구는 특정한 oligonucleotides에 PA가 선택적이고 빠르게 감지함을 형광물질인 OliGreen 를 사용하여 분석한 방법이다. OliGreen은 DNA에 대해서만 결합하여 형광을 나타내는 물질로 PA의 특정 최대 농도에 대해 DNA가 결합되어짐에 따라 형광의 측정으로 알 수 있었다. PA의 선택성을 알아 보기 위해 다른 oligonucleotide와의 형광의 변화를 알아보았다. 또 PA의 target oligonucletide와 PA 대신 BSA라는 다른 protein을 대한 결과를 통해서 PA는 오직 특정 oligonucletide에 대해서만 선택적으로 반응하고 그에 따른 구조적인 변화를 증명할 수 있었다. Part. 2 에서는 PA는 DNA뿐 만 아니라 특정한 peptide에 대해서도 선택적으로 결합함을 이용한 형광 연구를 하였다. Peptide는 형광물질인 OliGreen과 결합하지 않기 때문에 우리는 DNA를 이용하여 peptide을 컨쥬게이션 시키는 법은 native chemical ligation을 따랐다. 그리고 HPLC를 이용하여 각 물질에 대해서 분리할 수 있었다. DNA-peptide 혼성화된 물질에 peptide에 선택적으로 반응하는 PA를 결합시키면 형광의 세기가 감소함을 알 수 있다. 이는 상대적으로 크기가 큰 PA가 peptide에 결합되면서 DNA을 가리기 때문이다. 위의 결과를 통해 DNA-peptide가 선형적으로 결합되어 있음을 유추 해 낼 수 있다. 여기서 우리는 생체 내 존재하는 DNA, peptide, protein에 대해서 검출하는데 많은 도움을 줄 수 있을 것이다. Part. 3 에서는 단 분자인 fullerene C60 물질을 비이온성을 띄는 계면활성제 pluronic F127, P123에서의 용해도와 encapsulation에 대한 연구를 하였다. 계면활성제와 C60사이의 π-π 와 CH-π사이의 소수성 상호작용으로 인해 C60 가 micelle의 핵심부분에서 균일하게 분산되어 안정화 상태를 유지함을 알 수 있었다. 이러한 증거를 UV-vis, 형광세기와 micro-RAMAN 분광법이나 cyclic voltammetry를 통해 알 수 있다. 물에 대한 용해도를 높이기 위해 micelle를 이용함으로 인해 광역학적인 치료나 HIV, apoptosis, 신경보호 영역 등 생물학적 범위에서 많이 연구되고 있다.;This study used OliGreen (OG), and PA binding aptamer for the selective and sensitive detection of Protective Antigen (PA), based on decrease of fluorescence emission according to the change of the structure from the aptamer in the presence of PA. PA is the most extensively studied component of anthrax toxin. PA, which has a relative molecular mass 83,000, can also translocate proteins, and is being evaluated for use as a general protein delivery system. In Part 1, we have developed the method for the sensitive fluorescence detection of the Protective antigen, using the oligonucletide PAA1 and PAA2. PA binding aptamers titrated with PA at 38℃ for 5min using fluorescent OG. We found that the intensity of fluorescence decreased by increasing the concentration of PA. The titration concentration of PA ranged from 0 to 40nM PA. We also confirmed PA and PA binding aptamer can be detected from the double strands. In PART 2, we have developed the method for the sensitive fluorescence detection of the Protective antigen, using the oligonucleotide SE, and peptides that bind to PA with a high affinity. Here we describe a method for conjugation oligonucleotide to the N-terminus of recombinant proteins. We convert of amine-terminated oligonucleotides to thioester-functionalized oligonucleotides by using a bifunctional reagent bearing an N-hydroxysuccinimide ester and benzyl thioester group, followed by native chemical ligation with proteins containing an N-terminal cysteine. We confirmed the intensity of fluorescence decreased according to increasing the concentration of the PA. We also found the PA did not combine with the oligonucleotide. In PART 3, the solubilizing C60 in aqueous media is essential for many emerging biomedical technologies which exploit the unique chemical properties and physical structure of C60. However, the extremely poor solubility of C60 in water. To overcome the difficulty in aqueous phase C60 solubilization, two methods have been adopted; (a) to synthesize water-soluble C60 derivatives by chemically attaching hydrophilic functional groups to the pristine C60, (b) to solubilize C60 by suitable carriers which have hydrophobic cores or bilayers. Fullerene dissolves in the hydrophobic part of the micelle core while the polar groups of F127 or P123 located at the micelle-water interface are in direct contact with the water molecules. Once homogeneously dissolved, the fullerenes and fullerene derivatives exhibit an interesting range of biological activities, especially promising in the field of photodynamic therapy, HIV, neuroprotection and apoptosis.