Label-Free Detection of Mercuric Ion Using Single and Double-stranded DNA and Fluorophores

Abstract

수은은 인간의 건강, 환경적인 면에서 독성이 강하기 때문에 이를 검출하려는 노력이 지속적으로 이루어지고 있다. 최근 DNA의 염기 중 Thymine이 수은 이온과 결합을 할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그래서 DNA를 이용하여 수은 검출을 하려는 연구들이 진행되고 있다. 물질을 검출하는 데 있어서 비용, 시간, 간단한 방법 등이 중요하다. 초기에 보고된 방법은 DNA의 끝에 형광물질과 소광물질을 라벨링(Labeling)하여서 검출하는 것이다. 수은이온이 있을 때 형광물질과 소광물질이 만나서 형광이 나오지 않게 되는 “Turn-Off” 방식의 연구가 보고되었다. 이 후, 이를 이용한 많은 연구들이 이어지고 있다. 본 연구에서는 기존의 DNA에 형광물질을 붙이는 방법을 개선하고자 하였다. 이러한 방법은 형광물질을 붙이는 어려운 과정이 필요했기 때문에 방법도 간단하지 않고, 비용과 시간이 많이 들기 때문이다. 본 연구에서는 Δ-Ru(phen)2(dppz)2+ 형광물질을 사용하였다. 이 물질은 hydrophobic한 환경에서 형광이 크게 증가하는데 DNA의 backbone 안쪽은 hydrophobic하므로 이 물질이 DNA의 backbone 안쪽으로 intercalation하게 되면 형광이 증가하는 것에 의해 간단한 형광측정으로도 수은 이온을 검출할 수 있다. 이를 위하여 poly adenine (A11) 한 가닥과 poly thymine (T11) 한 가닥을 이용하여 만든 이중나선구조와 mismatch가 있는 이중나선으로도 실험하였다. 또한 Hg2+가 존재할 때 DNA의 배향상태가 바뀌었다는 것을 입증하기 위하여 분자의 배향상태를 알 수 있는 Circular Dichroism도 측정하여 수은 이온과 DNA가 결합하였을 때의 변화를 확인할 수 있었다. 이러한 원리들을 이용하여 Hg2+에 대하여 기존방법보다 간편하게 선택적인 검출이 가능하였다. 다른 방법으로, 수은 이온을 검출할 수 있는 염기서열을 가진 oligonucleotide를 이용하여 여러 가지 형광물질과 함께 검출이 되는지를 알아보았다. 이 oligonucleotide DNA는 수은 이온이 있을 때 접히면서 hairpin 구조를 만든다. 가운데는 linker부분으로 상보적 결합을 이룰 수 없는 한 가지의 염기서열 (여기에서는 cytidine이 사용되었다)로 되어있고 양쪽 끝이 접혔을 때 상보적이거나 thymine으로 되어 있어 T-Hg²^(+)-T 결합을 이룰 수 있도록 디자인한 sequence를 제작하였다. 사용한 형광물질로는 Δ-Ru(phen)₂(dppz)²^(+), ethidium bromide (EtBr)가 있다. Δ-Ru(phen)₂(dppz)²^(+)를 사용하여 단일가닥과 이중가닥에 수은 이온을 적정한 결과, 수은 이온이 증가할수록 형광값이 감소하는 결과를 얻을 수 있었다. 또한 DNA의 검출에 흔히 쓰이는 ethidium bromide (EtBr)로도 실험을 진행하였으며 ethidium bromide (EtBr)의 연구에서는 DNA가 금나노입자 (AuNPs)를 둘러싸는 성질을 이용한 실험도 하였다. EtBr의 경우에는 수은이온을 넣어 hairpin 구조를 만든 것이나 단일가닥이 차이를 보이지 않았고, 이중가닥의 경우에만 높은 형광값을 나타내었다. 금나노입자가 ethidium bromide (EtBr)와 만나면 색이 변하고 형광을 소광시킨다는 성질을 이용하여 실험한 결과에서도 단일가닥과 hairpin DNA의 차이는 거의 나타나지 않았다.;Obtaining new mercury detection methods that are cost-effective, rapid, facile and applicable to the environmental and biological environment is an important goal. Because of continuing concern over mercury in the environment and its bad effects on human health, Efforts of detecting mercuric ion are continuing. Recently, It revealed that one of the DNA bases can bind with mercuric ion. Now many Researchers use this characters. I researched it to change the existing method of attaching fluorophore with DNA for the better. The traditional way requires hard process and it spends a lot of time and expenses. At this time, I introduced Δ-Ru(phen)2(dppz)2+ which is DNA intercalator. Fluorescence intensity of this material increases obviously at hydrophobic condition. Inside of DNA backbone is hydrophobic circumstance. When this compound intercalates into DNA backbone, we can easily detect mercuric ion via increase of fluorescence intensity. I used two types of DNA sensor. One is the using of double stranded DNA, the other is single stranded DNA which can make hairpin structure. And I identified change of DNA shape using circular dichroism (CD) analysis, which have inform of molecular orientation. In conclusion, We can detect exact concentration of mercuric ion. Also, Δ-Ru(phen)₂(dppz)²^(+) can be used powerful material for the detection of mercuric ion. But, ethidium bromide cannot be used. Furthermore, we can recognize a single mismatch of DNA base throughout following researches.