Development of a monoclonal single chain Fv-Fc fusion antibody-based enzyme immunoassay for quantitative detection of amygdalin in foods

Abstract

Amygdlain은 분자량이 457인 hapten으로 식용으로 널리 재배되는 식물에 다량 포함되어 있다. Amygdalin은 여러 종류의 소화효소에 의해 가수분해되는데, 최종 산물로 CN을 생성하게 된다. Amygdalin의 분해산물인 cyanide는 ferric ion을 포함하는 효소들의 활성을 억제하는 효과를 나타내는데, 특히 cytochrome oxidase와 같은 효소의 활성을 저해함으로써 oxidative phosphorylation을 방해하여 tissue hypoxia와 그에 따른 병리 증상들을 초래하게 된다. 이와 같은 현상은 cyanide poisoning으로 잘 알려져 있으며, 여러 가지 식물의 섭취에 의해 일어나는 cyanide poisoning과 clinical report들이 몇 십 년 동안 지속적으로 보고되고 있다. Amygdalin은 alternative anticancer treatment에도 널리 사용되고 있는데, 항암효과에 대해서는 검증된 바 없지만 지금도 많은 사람들이 항암치료에 amygdalin을 사용하고 있으며 상업적으로 판매되고 있다. 따라서, 항암치료에 따른 cyanide poisoning 역시 지속적으로 보고되고 있으므로, cyanide나 cyanogenic glycoside들을 사전에 진단하고자 하는 시도들이 많이 이루어졌는데, 그 방법들은 공통적으로 복잡한 기계를 필요로 하며, 충분히 효율적이지 못하다는 단점이 있기 때문에 ELISA와 같은 단순하고 효율적인 방법으로 amygdalin을 진단하고자 하였다. 본 연구에서는 over-expression 이 어려웠던 기존의 Fab 형태의 항체를 subcloning하여 scFv형태로 바꾸고 mammalian cell culture를 이용, 약 1.5mg의 항체를 얻었다. 새로이 제작된 scFv-Fc fusion 항체를 이용하여 ELISA system을 구현하였으며 이것이 기존의 것보다 더 민감하고, 안정성이 높아 보다 향상된 detection ability를 나타낸다는 것이 입증되었다. 제작된 ELISA는 HPLC analysis 결과와 비교하여 free amygdalin detection과 대략적인 정량분석이 가능하다는 것이 되었다.;Amygdalin is a cyanogenic glycoside compound which is commonly found in the pits of many fruits, raw nuts, and in other plants. Amygdalin itself is not toxic, but it releases cyanide (CN) after hydrolysis in the intestine. Cyanide inhibits cellular oxidizing enzymes and induces cyanide poisoning which generates a range of clinical symptoms in the human. The aim of this work was to develop an assay capable of detecting amygdalin from food extracts. An indirect, competitive ELISA was developed for the rapid detection of amygdalin in various seeds and nuts. The assay uses a monoclonal single-chain Fv-Fc fusion antibody produced against amygdalin. A anti-human Fc ? horseradish peroxidase conjugated antibody was used to detect bound monoclonal antibody and subsequent enzymatic conversion of substrate resulted in clear differences in absorbance when assaying different concentrations of amygdalin. The present study developed a monoclonal scFv-Fc fusion antibody(Mab)?based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantitative detection of amygdalin in foods. The specificity of Mab BK#5 to free amygdalin was studied by affinity ELISA. The detection of amygdalin in foods was accomplished by indirect competitive ELISA. This ELISA was optimized to quantify amygdalin in foods. Once optimized, the ELISA was found to be highly specific. Detection limits of the assay are 10-6 ?M of free amygdalin. We confirmed the new Mab-based ELISA through HPLC analysis with the same samples.