Study of IN-2001, a HDAC inhibitor, and IN-1130, an ALK5 inhibitor, for the breast cancer treatment

Abstract

유방암은 우리나라 뿐만 아니라 전세계적으로 가장 흔히 발생하는 여성암 종이다. 이러한 유방암의 치료 및 예방을 위한 다양한 연구가 진행 중이나, 아직까지 그 효과는 만족할 만하지 않아 새로운 유방암 치료제의 개발이 필요하다. 또한 암 전이는 암환자가 사망하는 주된 원인으로 암의 발생 초기에 있어서 암의 증식을 억제하는 다양한 의약품들이 만들어지고 있지만 암의 전이에 있어서는 그러한 시도가 어려운 실정이다. 이에 본 연구에서는 신규 합성 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 IN-2001의 항암작용과 신규 TGF-β type I 수용체 (ALK5) 저해제인 IN-1130의 항전이 작용을 연구하고 그 작용기전을 규명함으로써 유방암 예방 및 치료에의 활용 가능성을 살펴보고자 하였다. 최근 신규 항암제로서 많은 연구자들의 관심이 집중되고 있는 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제는 암세포의 성장저해, 분화촉진, 세포사멸 유도 작용 등을 통해 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있으나, 그 정확한 작용 기전은 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 신규 합성 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 IN-2001의 항암작용과 그 작용기전을 사람 유방암 세포주에서 살펴보고자 하였다. IN-2001은 MCF-7 사람 유방암 세포주에서 세포내 히스톤 탈아세틸화 효소 활성을 저해하였으며, 히스톤 H4 단백질의 아세틸레이션을 증가시켰다. 또한, IN-2001은 사람 유방암 세포주들 (MCF-7, T47D, MDA-MB-231, MDA-MB-468)에서 에스트로겐 수용체와 p53 발현 여부와 상관없이, 현저하게 농도 의존적으로 세포증식을 억제하였으며, 특히 에스트로겐 수용체 양성 세포주에서 더 현저한 세포증식 저해 작용을 보였다. IN-2001의 세포증식 저해 효과는 세포주기 정지와 세포사멸 유도 작용을 매개로 나타났다. 세포주기 분석 결과 IN-2001은 MCF-7 세포에서 G2/M 세포주기 정지 및 세포사멸을 나타내는 지표인 sub-G1 peak 증가를 유도한 반면, MDA-MB-468 세포에서는 G0/G1 과 G2/M 세포주기 정지 및 sub-G1 peak 증가를 유도하였다. 이러한 IN-2001의 작용은 세포주기 및 세포사멸 조절인자들 (CDK 저해제 p21WAF1과 p27KIP1, cyclin B1, cdc2, cyclin D1, thymidylate synthetase)과 종양 억제 유전자 (p21WAF1, cyclin D2, gelsolin)들의 발현 변화를 수반하였다. IN-2001 처치시, caspase-3/7 효소 활성 증가와 더불어 pro-caspase-3 단백질의 active effector protease로의 전환이 일어났으며, 활성 산소종 생성 증가 및 cytochrome c 유리가 유도되었다. 그러나 Bcl-2/Bax 단백질 비율에는 영향이 없었다. 따라서 IN-2001에 의해 유도된 세포사멸 유도 작용은 caspase 활성 증가 및 cytochrome c 유리와 관련 있으나, Bcl-2/Bax pathway와는 무관한 것으로 생각되어진다. 또한 IN-2001은 에스트로겐 수용체 양성 유방암 세포주에서 에스트로겐 수용체 발현을 저해하였으나, 에스트로겐 음성 유방암 세포주에서 에스트로겐 수용체와 에스트로겐 반응성 유전자인 프로게스테론 수용체의 재발현을 유도하였다. TGF-β는 다양한 생리활성을 지닌 cytokine으로, 발암과정 초기에는 발암 억제 인자로, 그 이후에는 전구 암전이 인자로 전환하는 것으로 알려져 있다. TGF-ß는 발암 초기 단계에서 세포성장 저해 작용과 세포사멸을 유도하여 종양 억제 인자로서 작용하나, 발암과정이 진행될수록 TGF-β에 의한 세포성장 저해 작용은 사라지고, EMT (epithelial-mesenchymal transition), 침윤, 전이, 혈관신생, 면역억제 작용 등을 유도하여 종양의 전이와 악성화를 촉진한다. 따라서 TGF-β signaling의 저해는 새로운 암전이 치료 전략으로 생각되어지고 있다. 본 연구에서는 신규 TGF-β type I 수용체 (ALK5) 저해제인 IN-1130의 항전이 작용과 그 작용기전을 in vitro 사람 유방암 세포주와 in vivo 형질전환 유방암 동물 모델에서 규명하고자 하였다. IN-1130은 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐의 유방암에서 TGF-β에 의해 유도된 smad-2/3 인산화를 저해하였으며, MDA-MB-231 사람 유방암 세포주에서 TGF-β target 유전자인 p21WAF1, PAI-1, fibronectin 발현을 감소시켰다. 더구나, IN-1130은 TGF-β 에 의한 MCF-7 사람 유방암 세포주의 세포증식 저해 작용을 억제하였으나, TGF-β의 세포증식 저해 효과가 나타나지 않은 MDA-MB-231 사람 유방암 세포주의 세포증식에는 영향이 없었다. IN-1130은 TGF-β에 의해 증가된 MDA-MB-231 사람 유방암 세포주의 wound healing을 저해하였으며, 이러한 작용은 EMT 조절 인자들과 metalloproteinases (MMPs) 및 유방암 전이 관련 유전자들의 변화를 매개로 일어났다. TGF-β는 EMT의 mesenchymal marker인 N-cadherin, fibronectin과 EMT의 주 조절인자들인 Snail, SIP1, Twist 발현을 증가시켰으며, 종양 침윤 및 전이와 밀접한 관련이 있는 MMP-2, MMP-9, MT1-MMP 발현을 유도하였다. 또한, 유방암 전이 관련 유전자들인 CTGF, CXCR4, PTHrP, Twist의 경우에도 TGF-β에 의해 그 발현이 증가됨이 관찰되었다. 이러한 TGF-ß의 작용들은 모두 IN-1130 처치에 의하여 효과적으로 저해되었다. MMTV/c-Neu 형질전환 동물 모델에서도 IN-1130 투여에 의해 유방암의 폐로의 전이가 저해되었고, 이는 폐에서의 유방 특이적인 분화 지표인 β-casein 양의 감소로 확인되었다. 이러한 IN-1130의 항전이 효과는 MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐의 폐나 유방암에서 CXCR4, MMP-2 같은 유방암 전이 관련 유전자들의 발현 감소를 매개로 일어났다. 또한, IN-1130의 독성 평가를 위해, 용혈성 시험 및 설치류에서 단회투여 독성시험, 7일 반복투여 독성시험을 시행하였다. 단회투여 독성시험 후 minimal lethal dose 및 LD50 값을 비교한 결과, IN-1130은 비슷한 구조를 가진 다른 ALK5 저해제인 SB-505124에 비해 매우 독성이 적은 것으로 나타났다. 단회정맥투여 독성시험에서 IN-1130의 minimal lethal dose는 수컷과 암컷 랫드 각각에서 250 mg/kg과 200 mg/kg 이었으며, 수컷과 암컷 생쥐의 경우에는 각각 300 mg/kg 과 400 mg/kg으로 나타났다. 단회경구 투여 독성시험 결과, IN-1130의 LD50 값은 랫드와 생쥐 모두에서 2000 mg/kg 이상으로 평가되었다. 이러한 IN-1130의 독성은 일반적으로 생쥐보다 랫드 에서, 암컷보다 수컷에서 더 현저하게 나타났다. 7일 반복 정맥투여 독성시험 에서 IN-1130을 투여한 수컷 생쥐와 암컷 생쥐는 각각 250 mg/kg과 300 mg/kg 용량까지 어떠한 독성 작용도 관찰되지 않았다. 이상의 결과들로부터, IN-2001은 사람 유방암 세포주에서 세포주기 정지 및 세포사멸 유도를 매개로 현저한 암세포 증식 저해작용을 보였으며, 이로부터 신규 히스톤 탈아세틸화 효소 저해제인 IN-2001은 유방암에 대해 탁월한 항암작용을 가진 신규 항암 후보 물질로 사료된다. 또한, 신규 ALK5 저해제인 IN-1130은 유방암 전이 모델인 in vitro MDA-MB-231 사람 유방암 세포주와 in vivo MMTV/c-Neu 형질전환 생쥐에서 항전이 효과를 보였으며, 이로써 IN-1130과 같은 TGF-β type I 수용체 (ALK5) 저해제들에 의한 TGF-β signaling의 저해는 새로운 유방암 전이 치료법으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.;Breast cancer is the major cancer affecting females in Korea and around the world today. Breast cancer frequently metastasizes to lungs and bone, which is a common cause of morbidity and sometimes mortality. However, current therapeutic strategies for breast cancer are yet unsatisfactory and the vast majority of patients with metastasis remain incurable. Therefore, there is an urgent need to develop more effective therapeutic approaches for prevention and treatment of breast cancer. In this study, we have tried to evaluate the ability of a novel HDAC inhibitor, IN-2001, to inhibit the growth of primary tumors and the ability of a novel ALK5 inhibitor, IN-1130, to block the formation of secondary tumors (metastases) for breast cancer therapy. Histone deacetylases (HDACs) are enzymes involved in the remodelling of chromatin, and have a key role in the epigenetic regulation of gene expression. In recent years, inhibition of HDACs has emerged as a potential strategy to reverse aberrant epigenetic changes associated with cancer, and several classes of HDAC inhibitors have been found to have potent and specific anticancer activities in preclinical studies. But their precise mechanism of action has not been elucidated. In this study, a novel synthetic inhibitor of HDAC, 3-(4-dimethylamino phenyl)-N-hydroxy-2-propenamide [IN-2001] was examined for its antitumor activity and the underlying molecular mechanisms of any such activity on human breast cancer cell lines. IN-2001 effectively inhibited cellular HDAC activity (IC50 = 5.42 nM) in MCF-7 human breast cancer cells. Based on the western blot analysis, this HDAC inhibitory activity of IN-2001 was confirmed by an increase in histone H4 acetylation from the IN-2001-treated breast cancer cells. IN-2001 caused a significant dose-dependent inhibition of cell proliferation in human breast cancer cells with different estrogen receptor (ER) and p53 status (MCF-7, T47D, MDA-MB-231, and MDA-MB-468 cells). Cell cycle analysis revealed that the growth inhibitory effects of IN-2001 might be attributed to cell cycle arrest at G0/G1 and/or G2/M phase and subsequent apoptosis in human breast cancer cells. These events are accompanied by modulating several cell cycle and apoptosis regulatory genes (CDK inhibitors p21WAF1 and p27KIP1, cyclin B1, cdc2, cyclin D1, and thymidylate synthetase), and other tumor suppressor genes (p21WAF1, cyclin D2, and gelsolin). In addition, IN-2001 treatment resulted in induction of caspase-3/7 activity and conversion of the proenzyme of caspase-3 (p32) form to catalytically active effector proteases (p17 and p20) in human breast cancer cells. IN-2001 also triggered generation of reactive oxygen species (ROS) and cytosolic release of cytochrome c. However, IN-2001 did not change the Bax/Bcl-2 ratio. Collectively, IN-2001-induced apoptosis in human breast cancer cells is probably mediated through caspase activation and the mitochondrial/cytochrome c pathway, whereas the Bcl-2/Bax pathway appears not to be involved. We showed that IN-2001 reactivated the expression of estrogen receptor (ER)α and the endogenous ER-responsive gene, progesterone receptor (PR), in ER-negative human breast cancer cells, indicating that IN-2001-induced ER is functionally active. These findings may provide new therapeutic approaches, combination of antiestrogen together with a HDAC inhibitor, in the hormonal therapy-resistant ER-negative breast cancers. TGF-β plays a dual role in carcinogenesis as a tumor suppressor and a pro-oncogenic factor. In early stage tumors, TGF-β suppresses tumor development by inhibiting cell proliferation and inducing differentiation and apoptosis. As tumorigenesis develops, tumor cells often escape from TGF-β-mediated growth inhibition and overexpress TGF-β, which may promote malignant tumor progression by inducing epithelial-mesenchymal transition (EMT), invasion, metastasis, angiogenesis, and immunosuppression. The blockade of TGF-β signaling may thus be a novel strategy for treatment of metastatic cancer. In this study, we have evaluated the antimetastatic effects and the underlying mechanisms of a novel TGF-β type I receptor (TβRІ/ALK5) kinase inhibitor, IN-1130, on metastatic breast cancer models, MDA-MB-231 human breast cancer cells in vitro and MMTV/c-Neu transgenic mice in vivo. IN-1130 efficiently blocked TGF-β signaling, as detected by inhibition of TGF-β-mediated Smad2/3 phosphorylation in MMTC/c-Neu mice and TGF-β-regulated target gene expression such as p21WAF1, PAI-1, and fibronectin in MDA-MB-231 cells. IN-1130 also inhibited growth inhibition of MCF-7 cells mediated by TGF-β, but had no effect on MDA-MB-231 cells that were resistant to growth inhibitory effects of TGF-β. In a wound healing assay, IN-1130 decreased the TGF-β-stimulated migration of MDA-MB-231 cells in vitro. These events are accompanied by modulating drivers and mediators of EMT, matrix metalloproteinases (MMPs), and breast cancer metastasis-associated genes in MDA-MB-231 cells. TGF-β stimulated upregulation of mesenchymal markers of EMT such as N-cadherin and fibronectin and master regulators of EMT such as Snail, SIP1, and TWIST. TGF-β also induced the expression of MMP-2, MMP-9, and MT1-MMP, which have been closely associated with tumor invasion and metastasis. In addition, TGF-β enhanced the expression of several breast cancer metastasis-related genes such as CTGF, CXCR4, PTHrP, and TWIST in MDA-MB-231 cells. All these effects of TGF-β were efficiently abrogated by IN-1130. In vivo, treatment with IN-1130 significantly suppressed lung metastasis of mammary tumors in MMTV/c-Neu transgenic mice, as evidenced by the reduction in number of lung metastases and the decreased β-casein levels in the lungs of IN-1130-treated mice as compared with those of the control group. These antimetastatic effects of IN-1130 were associated with downregulation of breast cancer metastasis-related genes such as CXCR4 and MMP-2 in lungs and/or mammary tumors of MMTV/c-Neu mice. For the safety evaluation of IN-1130, we did the hemolysis test, the acute single-dose mortality studies, and the 7-days repeat-dose mortality study. We found out that IN-1130 did not cause the toxicity to erythrocytes in the hemolysis test and that IN-1130 was much less toxic than SB-505124, a TβRІ/ALK5 inhibitor with a prototypical imidazole scaffold, in the acute single-dose i.v. or oral mortality studies. The minimal lethal dose of IN-1130 in single-dose i.v. mortality study was 250 and 300 mg/kg for male and female rats, respectively, and 300 and 400 mg/kg for male and female mice, respectively. The LD50 value of IN-1130 in single-dose oral mortality study was estimated to be over 2000 mg/kg for both rats and mice. In general, rats were found to be somewhat more sensitive than mice, and males more sensitive than female, to the toxic effects of IN-1130. In the 7-days repeat-dose i.v. mortality study, no deaths or overt clinical signs of toxicity were observed in IN-1130-treated male and female mice at doses up to 250 mg/kg and 300 mg/kg, respectively. Taken together, our data suggest that this histone deacetylase inhibitor, IN-2001, is a novel promising therapeutic agent with potent antitumor effects against human breast cancers. In addition, A novel TβRІ/ALK5 inhibitor, IN-1130, showed the antimetastatic effects on metastatic breast cancer models, MDA-MB-231 human breast cancer cells in vitro and in MMTV/c-Neu transgenic mice in vivo, suggesting the blockade of TGF-β signaling by TβRІ/ALK5 inhibitors such as IN-1130 may eventually lead to a promising novel therapeutic strategy for metastatic breast cancer.