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Anti-cancer activity of Resveratrol and HDACi in human breast cancer cells in vitro and MMTV/c-Neu transgenic mice in vivo, and DR-CALUX bioassay for the detection of chemical carcinogens

Title
Anti-cancer activity of Resveratrol and HDACi in human breast cancer cells in vitro and MMTV/c-Neu transgenic mice in vivo, and DR-CALUX bioassay for the detection of chemical carcinogens
Authors
정기은
Issue Date
2005
Department/Major
대학원 약학과
Publisher
이화여자대학교 대학원
Degree
Doctor
Advisors
申尹容
Abstract
Part Ⅱ 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 새로운 종류의 항암 후보 물질로, 최근 다양한 구조의 히스톤 탈아세틸화효소 저해제가 암세포 증식 억제 작용, 분화 촉진 작용, 세포사멸 유도 작용 등을 나타내는 것으로 보고되었다. 그러나 아직 그 작용 메카니즘은 정확히 밝혀지지 않았다. 이에 본 연구에서는 다양한 종류의 히스톤 탈아세틸화효소 저해제(TSA, HC toxin, IN2001, SAHA, LAQ)의 항암 작용을 in vitro 사람 유방암 세포와 in vivo 형질전환 유방암 동물 모델에서 살펴보았다. 아울러, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제의 항암 작용 메카니즘을 규명하고자 하였다. 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 에스트로겐 수용체 양성 유방암 세포(MCF-7 세포와 T47D 세포)와 에스트로겐 수용체 음성 유방암 세포(MDA-MB-231 세포와 MDA-MB-468 세포) 모두에서 현저한 세포 증식 저해 효과를 보였다. 히스톤 탈아세틸화효소 저해제의 세포 증식 억제 효과는 에스트로겐 수용체 음성 유방암 세포보다 에스트로겐 수용체 양성 유방암 세포에서 더욱 두드러지게 나타났으며, 에스트로겐 수용체의 존재와 무관하게 실험에 사용된 모든 세포주에서 히스톤 탈아세틸화효소 저해제의 세포 증식 저해 효과는 LAQ, TSA, HC toxin ≫ IN2001, SAHA의 순으로 나타났다. MMTV/c-Neu 형질전환 유방암 동물에서도 히스톤 탈아세틸화효소 저해제의 항암 효과가 확인되었다. 15 mg/kg IN2001 또는 120 mg/kg SAHA를 투여한 형질전환 생쥐에서 대조군에 비해 유방암의 무게가 현저히 감소하였다. 히스톤 탈아세틸화효소 저해제에 의한 유방암 세포 증식 억제 효과는 세포주기 정지 및 세포사멸 유도를 매개로 일어났다. 세포주기분석 결과, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제 처치 시 G2/M 주기가 현저히 증가하였으며, 동시에 apoptotic cell을 나타내는 sub-G1 peak가 증가하였다. 히스톤 탈아세틸화효소 저해제에 의한 세포주기 정지는 p21^(WAF1) 및 p27^(KIP1)과 같은 cdk 저해제의 유전자 발현 증가를 매개로 일어났으며, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제에 의한 세포사멸 유도는 caspase 3/7 활성 증가, 활성산소종 생성 증가, 그리고 Bax/Bcl-2 비율 증가에 따른 cytochrome C 유리를 매개로 일어났다. 또한 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 DNA 복제 및 수복에 필수 효소인 thymidylate synthase의 유전자 발현을 감소시켰다. 세포 증식 억제 작용과 더불어, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 에스트로겐 수용체 음성 유방암에서 에스트로겐 수용체의 재발현을 유도하였다. 에스트로겐 수용체 음성 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포에 히스톤 탈아세틸화효소 저해제를 처치하였을 때, 에스트로겐 수용체 α가 재발현 되었으며, 에스트로겐 수용체의 target 유전자인 프로게스테론 유전자의 발현 또한 증가하였다. 이러한 에스트로겐 수용체 재발현 현상은 30 mg/kg IN2001을 투여한 MMTV/c-Neu 형질전환 유방암 동물 모델에서도 확인되었다. 결론적으로, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 in vitro 사람 유방암 세포와 in vivo 형질전환 유방암 동물 모델에서 유의적인 항암 효과를 보였으며, 이는 세포 주기 정지 및 세포사멸 유도를 매개로 일어남을 알 수 있었다. 이상의 연구 결과로부터, 히스톤 탈아세틸화효소 저해제는 호르몬 의존성/비의존성 유방암 치료에 있어서 새로운 항암 물질로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.;Part Ⅲ 다이옥신류 화합물은 생태계 및 인체에 유해한 영향을 미치는 환경오염물질로 발암성을 지니고 있으며, 급성, 만성, 면역, 유전 등 폭넓은 분야에 강한 독성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 이들 물질에 대한 사회적 관심이 날로 증가하고 있으며 이들에 대한 합리적인 위해성 평가를 위해서는 적절한 검색 시험법의 개발이 시급하다. 이에 본 연구에서는 다이옥신류 화합물의 검색을 위한 바이오 분석법으로써 DR-CALUX 바이오 분석법을 확립·검증하고 이를 활용하여 사람 혈액 시료, 수질 환경 시료, 토양 환경 시료 등의 다양한 매체에서 다이옥신류 화합물의 오염도를 측정하였다. 또한 DR-CALUX 바이오 분석법을 이용하여 WHO-TEF 수치를 갖지 않는 화합물들이 다이옥신성 활성을 나타내는지 여부를 살펴보았으며, 혼합물 형태의 다이옥신류 화합물에서 이들 물질간의 상호 작용을 조사하였다. 먼저 DR-CALUX 바이오 분석법의 타당성을 검토하기 위하여, DR-CALUX 바이오 분석법과 EROD 바이오 분석법으로부터 도출된 2,3,7,8-TCDD 용량 반응성을 비교하였다. 그 결과, 두 가지 시험법은 높은 상관성을 보였으며 (r² = 0.89), 이로부터 DR-CALUX 바이오 분석법이 유용한 다이옥신 검색법임을 알 수 있었다. 다음으로 현재 화학분석법의 대상이 되고 있는 17종의 PCDD/PCDF 이성체에 대하여, DR-CALUX 바이오 분석법으로부터 도출된 상대효능치 (IEF)를 WHO에서 지정한 TEF 수치와 비교하였다. 그 결과, 다이옥신류 화합물의 구조에서 염소기의 수가 많을수록 IEF 수치가 WHO-TEF 수치보다 높은 것으로 나타났다. WHO-TEF 수치가 없는 화합물에 대하여 다이옥신성 활성을 나타내는지 살펴보기 위하여, DR-CALUX 바이오 분석법을 이용하여 PCB류, PAH류, PCDD/PCDF류의 다이옥신성 활성을 살펴보았다. PCB77, PCB81, PCB126 그리고 PCB169와 같은 non-ortho coplanar PCB류는 높은 다이옥신성 활성을 보인 반면, mono-ortho coplanar 구조인 PCB118과 PCB138, PCB153, PCB180과 같은 non-coplanar PCB류는 다이옥신성 활성을 보이지 않았다. PAH류의 경우, benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[a,h]anthracene, chrysene과 같이 다섯 개 혹은 여섯 개의 방향족 고리를 갖는 PAH류 화합물은 높은 다이옥신성 활성을 나타낸 반면, 그보다 작은 수의 방향족 고리를 갖는 PAH류 화합물은 다이옥신성 활성을 나타내지 않았다. 다이옥신성 화합물의 혼합물에서 이들 물질간의 상호 작용을 살펴보았을 때. 2,3,7,8-TCDD와 PCB류를 병용 처치하였을 때, 모든 PCB류에서 길항작용이 관찰되었다. 그러나 PCB77의 경우 다른 PCB류에 비하여 길항작용이 약하게 나타났다. PAH류와 2,3,7,8-TCDD를 병용 처치하였을 때, 단독으로 강한 다이옥신성 활성을 나타냈던 PAH류들, 즉 benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[a,h]anthracene, chrysene은 강한 길항 작용을 나타내었다. 반면, 다이옥신성 활성을 보이지 않았던 acenaphthene, anthracene, fluorene, naphthalene, pyrene, phenanthrene, carbazole은 약한 길항작용을 보이거나, 상가 작용을 보였다. 흥미롭게도 fluoranthene과 2,3,7,8-TCDD 혼합물의 경우 상승 작용이 관찰되었다. 마지막으로 DR-CALUX 바이오 분석법을 활용하여 다양한 매체에서 다이옥신류 화합물의 오염도를 측정하였다. 자궁내막증 환자군과 대조군의 혈중 다이옥신 농도를 측정하였을 때, 대조군의 CALUX-TEQ 수치는 41 pg CALUX-TEQ/L로 나타났고, 환자군의 CALUX-TEQ 수치는 154 pg CALUX-TEQ/L로 나타났다. 자궁내막증 단계별 CALUX-TEQ 수치를 살펴보면 자궁내막증 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ각 단계에서 각각 71, 80, 188, 283 pg CALUX-TEQ/L로 나타났다. 이러한 결과로부터, 혈중 다이옥신 농도가 높을 수록 자궁내막증의 발생 확률이 높으며 그 정도도 심한 것으로 나타났다. 다음으로 수질 및 토양 환경 시료를 대상으로 다이옥신류 화합물의 오염도를 측정하였다. 그 결과, 수질 시료에서는 다이옥신류 화합물이 거의 검출되지 않은 반면 토양 시료에서는 CALUX-TEQ 수치가 0.6 ∼ 650 pg CALUX-TEQ/g (dry)으로 나타났다. DR-CALUX 바이오 분석법으로부터 도출된 TEQ 수치를 HRGC/MS 분석법으로부터 도출된 TEQ 수치와 비교하였을 때, 매우 높은 상관성을 보였다 (r² = 0.98). 그러나 그 절대적 수치를 비교해보면, CALUX-TEQ 수치가 HRGC/MS-TEQ 수치보다 10배 이상 높은 것으로 나타났다. 이상의 결과들로부터, DR-CALUX 바이오 분석법은 타당성 있고 신뢰성 있는 다이옥신 검색 시험법임이 입증되었으며, 다양한 매체 중의 다이옥신류 화합물을 신속하고 민감하게 검색할 수 있는 초기 검색 도구로써 적극 활용될 수 있을 것으로 사료된다.;Part Ⅲ Dioxin-like compounds are now in the center of public, regulatory, and scientific attention because they are ubiquitous environmental pollutants that could be accumulated in biological system and toxic to human and wildlife. Given this issues, it is important to develop a reliable dioxin detection methods for a rational risk assessment of dioxin-like compounds. In this study, we tried to establish and validate a new bioassay method, DR-CALUX bioassay and make use it as a screening method for a measurement of dioxin-like compounds in the various matrices, such as human blood sample, environmental water sample, and soil sample. In addition, using this DR-CALUX bioassay system, we examined a number of chemicals without assigned WHO (World Health Organization)-TEF values if they have dioxin-like activity and the potential interaction between dioxin-like compounds. Firstly, in order to determine whether the DR-CALUX bioassay could predict the effect of dioxin-like compounds, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) dose response from DR-CALUX bioassay was compared with that from EROD assay. The correlation coefficient (r²) was found to be 0.89, indicating a good correlation between two different methods and the possibility of DR-CALUX bioassay as a useful dioxin detecting method. Secondly, we calculated the Induction Equivalency Factors (IEFs) for the representative 17 kinds of PCDD/F congeners using this bioassay system and than compared them with WHO-TEF values. It seemed to be a pattern in that the more highly chlorinated PCDD/F congeners have higher IEF values than WHO-TEF values. Thirdly, we examined a number of chemicals (such as PCBs, PAHs, and PCDD/F congeners) without assigned WHO-TEF values if they have dioxin-like activity. PCB congeners with non-ortho coplanar structure, such as PCB77, PCB81, PCB126, and PCB169 showed potent dioxin-like activity. However, mono-ortho coplanar PCB118 and non-coplanar PCBs, such as PCB138, PCB153, and PCB180 did not show dioxin-like activity. In case of PAHs, PAHs bearing five or six aromatic rings, such as benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[a,h]anthracene, and chrysene showed significant luciferase induction, whereas PAHs with lower number of aromatic rings showed minimal effect. In addition, we found the non-additive interaction between dioxin-like compounds. The combination treatment of 1 μM PCBs and 50 pM 2,3,7,8-TCDD showed antagonistic interaction whether PCB alone is AhR active (coplanar PCBs) or not (non-coplanar PCBs). However, the antagonistic interaction between PCB77 and 2,3,7,8-TCDD was not as potent as that between other PCBs and 2,3,7,8-TCDD. When PAHs were administered with 50 pM 2,3,7,8-TCDD, potent AhR active PAHs, such as benzo[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, benzo[k]fluoranthene, benzo[a,h]anthracene and chrysene, exhibited antagonistic interactions, while inactive PAHs, such as acenaphthene, anthracene, fluorene, naphthalene, pyrene, phenanthrene, and carbazole showed weak antagonistic interactions or additive interactions. Interestingly, mixture of 2,3,7,8-TCDD and fluoranthene showed synergistic interaction. Finally, we used DR-CALUX bioassay as a screening tool to assess dioxin-like compounds in the various matrices. When we assessed serum dioxin level of endometriosis patients and control patients, mean TEQ value of control group and case group was 41 pg CALUX-TEQ/L and 154 pg CALUX-TEQ/L, respectively. And the mean TEQ values of endometriosis stage Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, and Ⅳstage were 71, 80, 188, and 283 pg CALUX-TEQ/L, respectively. These results suggested that there was a significant association between serum dioxin concentration and the occurrence and severity of endometriosis. Next, we examined the dioxin-like activity of environmental water and soil sample. All of the samples showed minimal dioxin-like activity, whereas soil samples caused significant dioxin-like activity with CALUX-TEQ values ranging from 0.6 to 650 pg CALUX-TEQ/g(dry). When we compared the TEQ values from DR-CALUX bioassay and HRGC/MS chemical analysis, there was good correlation (r²=0.98). However, the absolute TEQ values of DR-CALUX bioassay were always higher than that of HRGC/MS chemical analysis. Taken together, the DR-CALUX bioassay can be recommended as a pre-screening tool for routine measurement of dioxin-like compounds in environments. They have a great deal of advantages; extremely sensitive, rapid, easy sample clean-up, small sample size, much reduced cost compared to instrumental methods, applicable to wide variety of matrices, biologically relevant.;Part Ⅰ 유방암은 여성암 중 가장 흔한 암 종으로 2002년 우리나라 전체 여성암 환자 중 16.8%로 1위를 차지하였고, 위암, 폐암, 간암, 대장암에 이어 다섯 번째로 사망률이 높은 암으로 보고되고 있다. 이러한 유방암의 치료 및 예방을 위하여 다양한 연구가 진행 중이나, 아직까지 그 효과는 아직 만족할 만하지 않다. Resveratrol은 식물에 함유된 stilbene 구조의 폴리페놀성 물질로 다양한 암 종에서 강한 항암 효과를 나타내는 것으로 보고되어 왔다. 그러나, 유방암 세포에서의 resveratrol의 생리 활성에 대한 기존의 연구 결과는 논쟁의 여지가 있으며, 정확한 작용 기전에 대해서는 아직 자세히 밝혀져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 에스트로겐 수용체 양성 및 음성 유방암 세포에서 resveratrol의 다양한 생리 활성을 연구하고 그 메카니즘을 규명함으로써 유방암 예방 및 치료에의 활용 가능성을 살펴보고자 하였다. Resveratrol은 농도 및 시간 의존적으로 사람 유방암 세포의 증식을 현저히 억제하였고, 이러한 세포 증식 억제 효과는 일시적인 S 주기 증가 및 세포사멸 증가 현상을 수반하였다. Resveratrol에 의한 S 주기 증가는 p21^(WAF1) 및 p27^(KIP1)과 같은 cdk 저해제의 유전자 발현 감소를 매개로 일어나며, resveratrol에 의한 세포사멸은 caspase 3/7 활성 증가 및 cytochrome C 유리와 관련될 것으로 보인다. 세포증식 억제 작용뿐만 아니라, resveratrol은 사람 유방암 세포에서 강한 항산화 효과를 보였다. Resveratrol 처치 시, 기저 활성산소종 뿐 아니라, 과산화수소나 카테콜 에스트로겐과 같은 산화적 스트레스에 의해 유발된 활성산소종도 감소시켰다. 또한, resveratrol은 대다수의 발암물질의 대사 활성화에 관여하는 CYP1A1과 CYP1B1 효소의 발현 및 효소 활성을 유의적으로 저해하였다. 에스트로겐 수용체 양성 사람 유방암 세포에서, resveratol은 mixed estrogenic/anti-estrogenic 활성을 나타냈다. Resveratrol이 단독으로 존재하거나 1 pM 이하 농도의 E2와 함께 존재할 때, 5 μM ∼ 10 μM 농도의 resveratrol은 에스트로겐 활성을 보였으나, 50 μM 이상 농도의 resveratrol은 안티에스트로겐 활성을 보였다. 그러나, 10 pM 이상의 E2와 함께 존재할 경우, resveratrol은 안티에스트로겐으로 작용하였다. 이상의 결과들로부터, resveratrol은 개시(initiation), 촉진(promotion), 그리고 진행(progression)으로 대별되는 다단계의 발암과정을 막을 수 있는 효과적인 화학적 암 예방제로 사료된다. Resveratrol에 의한 세포 증식 억제 작용은 암의 진행 단계를, 항산화 작용 및 대사효소 저해 작용은 암의 개시 및 촉진 단계를 억제하는데 기여할 것으로 추정된다.;Part Ⅰ Despite years of intensive research, breast cancer remains a major cause of death among women. New strategies to combat breast cancer are being developed, one of the most exciting of which is the use of chemopreventive agents. Resveratrol is a polyphenolic compound found in plants that seems to afford protection against several types of cancer via a wide spectrum of biological activity. However, its effects on the breast cancer cells are controversial and the precise mechanisms of action are not clear yet. Therefore, in this study we investigated the various biological effects of resveratrol on the human breast cancer cells in order to provide the insight of its utility as a chemopreventive agent. Resveratrol caused significant growth inhibition of human breast cancer cells, which was manifested by transient cell cycle accumulation at S phase and induction of apoptosis. Resveratrol-mediated cell cycle arrest was related to the down-regulation of cyclin dependent kinase (cdk) inhibitors, such as p21^(WAF1) and p27^(KIP1) and cyclins, such as cyclin D1 and cyclin B1. And resveratrol-induced apoptosis was dependent on the caspase 3/7 activation and cytochrome C release. In addition, this study showed potent anti-oxidative activity of resveratrol in human breast cancer cells. Resveratrol significantly decreased basal reactive oxygen species (ROS) level as well as activated ROS level by oxidative stimuli, such as H₂O₂ or catechol estrogens. Furthermore, resveratrol inhibited the transcriptional activity and catalytic activity of CYP1A1 and CYP1B1 metabolism enzymes, which are important enzymes that mediate metabolic activation of majority of chemical carinogens. In estrogen receptor (ER) positive breast cancer cells, resveratrol showed mixed estrogenic/anti-estrogenic activity. Resveratrol alone showed mixed estrogenic/anti-estrogenic activity. In the absence of 17β-estradiol (E2) or in the presence of low concentration (≤1 pM) of E2, resveratrol showed estrogenic activity at the concentrations from 5 μM to 10 μM and antagonistic activity at the concentration greater than 50 μM. However, in the presence of sufficient high concentration (≥10 pM), resveratrol invariably acted as an antiestrogen. Taken together, these results indicated that resveratrol may provide a remarkable promise as a potent chemopreventive agent. Resveratrol can effectively block the carcinogenesis at the three major stages of breast carcinogenesis; initiation, promotion, and progression. The anti-proliferative effects of resveratrol indicate its inhibitory effect on cancer progression. In addition, its anti-oxidative effects and inhibitory effect aganist metabolic enzymes may attribute to the blocking of initiation as well as promotion in carcinogenesis.;Part Ⅱ Histone deacetylase (HDAC) inhibitors are emerging as an exciting new class of potential anti-cancer agents. In recent years, a number of structurally diverse HDAC inhibitors have been identified and these HDAC inhibitors induce growth arrest, differentiation and/or apoptosis of cancer cells in vitro and in vivo. However, the underlying molecular mechanisms remain unclear. This study aimed at investigating the anti-tumor activity of various HDAC inhibitors, such as TSA, HC toxin, IN2001, SAHA and LAQ, using human breast cancer cells in vitro and in vivo. Moreover, the possible mechanism by which HDAC inhibitor exhibit anti-tumor activity was also explored. In both ER positive (MCF-7 cells and T47D cells) and ER negative human breast cancer cells (MDA-MB-231 cells and MDA-MB-468 cells), HDAC inhibitors showed remarkable anti-proliferative effects in dose-and time-dependent manner. In interest, ER positive breast cancer cells were more susceptible to HDAC inhibitors than ER negative breast cancer cells although the growth inhibitory potency was commonly the order of LAQ, TSA, HC-toxin ≫ IN2001 ≥ SAHA in each cell lines. In addition, this anti-tumor activity of HDAC inhibitors was also confirmed in vivo mammary tumor model (MMTV/c-Neu transgenic mice). HDAC inhibitors, such as 15 mg/kg IN2001 and 120 mg/kg SAHA showed a marked reduction of mammary tumor weights in MMTV/c-Neu mammary tumor model. These growth inhibitory effects were related to the cell cycle arrest and induction of apoptosis. Flow cytometry studies revelaed that HDAC inhibitors showed accumulation of cells at G2/M phase. At the same time, HDAC inhibitor treatment time-dependently increased sub-G1 population, representing apoptotic cells. HDAC inhibitor-mediated cell cycle arrest was associated with HDAC inhibitor-mediated induction of cdk inhibitor expression. In T47D cells and MDA-MB-231 cells, HDAC inhibitors significantly increased p21^(WAF1) and p27^(KIP1) expression. Similarly, increased p21^(WAF1) expression was also observed in vivo mammary tumor and uterus tissue. In addition, thymidylate synthase, an essential enzyme for DNA replication and repair, was down-regulated by HDAC inhibitors in the human breast cancer cells. In regard to apoptosis, HDAC inhibitors induced caspase 3/7 activation and ROS generation. Moreover, increased cytochrome C release was also observed which was closely related to the increased relative ratio of Bax/Bcl-2. In addition to their anti-proliferative effect, HDAC inhibitors incuded re-expression of ERα gene in the ER negative breast cancer. MDA-MB-231 cells treated with HDAC inhibitors showed remarkable increase in ERα mRNA level. At the same time, an estrogen-responsive PR gene was also re-expressed by HDAC inhibitors, suggesting induced ER is functional. Moreover, we confirmed these ERα re-expression in vivo mammary tumor model. In summary, HDAC inhibitors induced growth inhibition, cell cycle arrest, and eventual apoptosis in human breast cancer cells with different ER status. This occurred possibly through modulation of cell cycle and apoptosis regulatory proteins, such as cdk inhibitors, cyclins, and thymidylate synthase. Taken together, these results provide an insight into the utility of HDAC inhibitors as a novel chemotherapeutic regime for hormone sensitive and insensitive breast cancer.
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